冯越组发表文章报道AcrIF24抑制I-F型CRISPR-Cas系统的分子机制
2022/5/25 15:30:00 我是科学家iScientist

     2022年4月11日,冯越研究组在Nature Communications在线发表了题为Insights into the inhibition of type I-F CRISPR-Cas system by a multifunctional anti-CRISPR protein AcrIF24的研究论文,文章报道了AcrIF24蛋白、AcrIF24-Csy复合物以及两种AcrIF24-Csy-dsDNA复合物的三维结构,揭示了AcrIF24的Acr-Aca(Anti-CRISPR associated)双重功能以及对I-F型CRSRPR-Cas系统的多重抑制机制。

    

     网页截图

     CRISPR-Cas系统作为原核生物的获得性免疫系统,为细菌及古细菌对抗外来入侵提供了强有力的保护。在阐明工作机制的同时,科学家也将其开发为高效的基因编辑工具,詹妮弗·杜德纳(Jennifer Doudna)和埃马纽尔·夏彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)教授由于在该领域的贡献获得2020年诺贝尔化学奖。

     同时,以噬菌体为代表的可移动遗传原件也进化出相应的手段以制约CRISPR-Cas系统,如编码Anti-CRISPR(Acr)蛋白等。Acr蛋白可作为天然的“刹车”,因而在基于CRISPR-Cas的基因编辑系统中可被开发为调控工具。另一方面,阐明Acr蛋白抑制机制也能够反映CRISPR-Cas系统发挥作用时的弱点环节,进一步加深我们对CRISPR-Cas系统的认知。

     CRISPR-Cas系统根据具体的蛋白组成,被划分为多个亚型。其中,I-F型CRISPR-Cas系统在细菌中广泛存在,最近也被应用于基因组编辑与表达调控,针对I-F型CRISPR-Cas系统的Acr蛋白也是最早被发现,并且数量较多(共24个)。由于Acr蛋白的重要性及其序列之间相似度低,众多研究者都希望通过解析Acr蛋白三维结构以阐明作用机制。

     北京化工大学生命学院冯越教授研究组近年来对多种I-F型Acr蛋白的工作机制进行了研究,先后揭示了AcrIF11[1],AcrIF14[2],AcrIF13[3]以及AcrIF5[4]的工作机制。此前冯越教授还受邀在RNA Biology上发表综述,系统阐述了I-F型CRISPR-Cas系统的Acr蛋白发挥功能的分子机制[5]。

     在本研究中,冯越研究组首先解析了AcrIF24的中部结构域截短体蛋白AcrIF24ΔMD的晶体结构,并通过生物信息学分析以及细胞实验,证明了AcrIF24的C端结构域具有Aca蛋白的功能,能够抑制acr操纵子的转录。AcrIF24也是首个得到结构解析与功能阐明的Acr-Aca双功能蛋白。

     接着,研究者探究了AcrIF24蛋白的功能,发现它可直接结合Csy,即I-F型CRISPR-Cas系统中结合靶标DNA的效应蛋白复合物。接下来,冯越研究组与清华大学杨茂君教授课题组合作使用冷冻电镜技术解析了AcrIF24-Csy复合物的结构,他们发现一个AcrIF24二聚体可以结合两分子Csy,形成异源四聚体复合物(图1A)。

     此外,虽然Csy复合物中crRNA与靶标DNA的结合受到AcrIF24的空间位阻影响,但AcrIF24-Csy复合物仍然可以吸附序列非特异性的dsDNA,并形成更高形式的复合物,从而“误导”Csy复合物结合到外源dsDNA中的“无效”部位。这种误导不仅使得靶标DNA与Csy复合物无法正确结合,更可能使得AcrIF24-Csy复合物吸附并固定在无关的DNA序列上,从而无法自由移动。

     研究者还进一步解析了AcrIF24-Csy结合靶标以及非靶标dsDNA的两种AcrIF24-Csy-dsDNA复合物的三维结构(图1B),并通过一系列生化实验阐明了AcrIF24诱导Csy复合物产生对dsDNA非特异性吸附的机制与特点。他们发现在该非特异性吸附中,Csy复合物的PAM识别区域(K wedge)以及AcrIF24的HTH结构域是必要的功能元件,并且该作用在AcrIF23的anti-CRISPR活性中发挥功能。

    

     图1 AcrIF24-Csy(A)以及AcrIF24-Csy-dsDNA(B)三维结构

     总的来说,本研究解析了AcrIF24蛋白的结构,并发现其同时具有(1)在Csy识别靶标DNA时产生空间位阻;(2)与Csy形成异源四聚体复合物;(3)产生非特异DNA吸附这三方面的作用(图2)。这些作用机理的阐明,为其他Acr-Aca蛋白的研究提供了思路,也为将其开发为I-F型CRISPR-Cas基因编辑的调控工具奠定了基础。

    

     图2 AcrIF24抑制机制示意图

     值得一提的是,冯越研究组于2021年在Nucleic Acids Research杂志报道的AcrIF14[2],以及Blake Wiedenheft以及Alan R Davidson研究组报道的AcrIF9均可稳定结合Csy阻止靶标dsDNA识别,同时诱导非特异性DNA无效吸附,这表明诱导非特异性DNA无效吸附可能在多种Acr蛋白中广泛存在。

     致谢

     北京化工大学博士后杨灵光(已出站)、清华大学博士后张来幸、北京化工大学博士后尹培培(已出站)以及硕士研究生丁浩为本论文的共同第一作者,冯越教授为本文的通讯作者。清华大学杨茂君教授在电镜结构解析中提供大量指导,电镜数据和晶体衍射数据收集分别得到南方科技大学冷冻电镜中心和上海光源的大力支持。

     参考文献

     [1] Niu, Y., et al., A Type I-F Anti-CRISPR Protein Inhibits the CRISPR-Cas Surveillance Complex by ADP-Ribosylation. Mol Cell, 2020. 80(3): p. 512-524 e5.

     [2] Liu, X., et al., Insights into the dual functions of AcrIF14 during the inhibition of type I-F CRISPR-Cas surveillance complex. Nucleic Acids Res, 2021. 49(17): p. 10178-10191.

     [3] Wang, H., et al., Mechanistic insights into the inhibition of the CRISPR-Cas surveillance complex by anti-CRISPR protein AcrIF13. J Biol Chem, 2022. 298(3): p. 101636.

     [4] Xie, Y., et al., AcrIF5 specifically targets DNA-bound CRISPR-Cas surveillance complex for inhibition. Nat Chem Biol, 2022.

     [5] Yang, L., et al., Structural insights into the inactivation of the type I-F CRISPR-Cas system by anti-CRISPR proteins. RNA Biol, 2021. 18(sup2): p. 562-573.

     作者:冯越研究组

     编辑:靳小明

     排版:尹宁流

     题图来源:研究论文

     研究团队

     冯越教授研究组(https://life.buct.edu.cn/2019/1031/c708a5650/page.htm)一直致力于利用结构生物学、生物化学、细胞生物学等多种手段研究微生物与宿主免疫系统的相互作用的分子机理。目前以通讯作者身份在Nature、Nat. Chem. Biol.、Mol. Cell、Nat. Plants、Nat. Commun.以及Nucleic Acids Res.等杂志发表论文多篇。课题组长期招聘副教授、讲师及博士后,欢迎有噬菌体生物学、核酸生物化学、结构生物学、生物信息学等研究背景,且对生命科学研究有强烈兴趣的人员申请。该实验室根据个人研究背景提供有竞争力的薪资待遇。欢迎加盟和来函咨询 (forest66318@163.com)。

     论文信息

     发布期刊Nature Communications

     发布时间 2022年4月11日

     论文标题Insights into the inhibition of type I-F CRISPR-Cas system by a multifunctional anti-CRISPR protein AcrIF24

     (DOI:https://doi.org/10.1038/s41467-022-29581-1)

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