基因的时间开关——TetTag系统
2020/5/21 2:35:37 生物流BioStream
TetTag系统包括Tet-ON和Tag-OFF两类，下面以Tag-OFF系统为例，来了解下这一基因开关的原理。
Tet-Off系统包括两个基因片段。片段一，由一个启动子和tTA(tetracycline-controlled transactivator，四环素控制的激活因子)基因组成。以即刻早期基因c-fos的启动子为例。当神经元兴奋时，c-fos启动子的存在，会让tTA瞬间表达。
片段一：c-fos启动子和tTA
tTA基因表达的蛋白tTA是一种转录激活因子，可以结合到Tet-Off系统的第二个基因片段的一个启动子上，使启动子后面的基因开始表达。该启动子名为Teto(或叫Tet-operator，或叫TRE，tetracycline-responsive element)，只有结合tTA才会启动后续基因的表达，我们期望表达的荧光蛋白基因就位于此处。
片段二：可被tTA激活的tetO启动子，tTA的突变版本tTA*，以及目标基因(如上图中的tau-LacZ)
总结一下，当神经元兴奋时，片段一上的即刻早期基因c-fos启动子会让tTA表达，tTA结合到片段二的teto启动子上，启动后续目标基因的表达。
换句话说，目标基因的表达依赖于tTA和teto启动子的结合。如果科学家要关闭目标基因的表达，在此处做手脚即可。科学家的手段是四环素类药物，如强力霉素(doxycycline)，强力霉素会跟tTA转录激活因子结合，使其丧失结合teto启动子的能力。teto启动子无法启动，目标基因的表达也就关闭了。
这是TetTag系统开关基因表达的最基本原理。
四环素的派生物：强力霉素(doxycycline)
但如此简单的TetTag系统并不能实现科学家持久标记两种记忆印记神经元的目标。
我们知道，即刻早期基因c-fos是瞬态表达的，如果神经元不再兴奋，即刻早期基因c-fos也不会再表达，最终也会导致荧光蛋白基因不再表达。但这不是科学家想要的结果，因为荧光蛋白会被降解，过一段时间便不可见。
为了让荧光蛋白的表达在启动后能持续，科学家在第二个基因片段上添加了另外一个基因片段：tTA*基因。tTA*基因是tTA基因的突变，它表达的是突变蛋白tTA*，也可以激活teto启动子，开启荧光蛋白的表达。同时，teto启动子也可以启动tTA*的表达。
这样一来，就形成了一个闭环的正反馈系统。teto启动tTA*的表达，tTA*表达的转录因子又可以激活teto启动子，再次启动tTA*和荧光蛋白的表达。它们可以无限循环下去，荧光蛋白也就可以持续表达下去。
为什么要用tTA*这一突变体，而不直接用tTA呢？这跟四环素这类药物开关有关。
我们知道，当强力霉素存在时，四环素会结合tTA转录激活因子，使其失去结合teto启动子的能力，荧光蛋白也就无法再表达。这时，TetTag系统就关闭了，不再标记兴奋的神经元。这是科学家想要的开关效果。
但对于已经被标记的神经元，科学家依旧希望它们能表达荧光蛋白。这时，tTA*这一突变体作用就显现出来了。
tTA*作用跟本体tTA类似，但它不跟四环素结合。也就是说，四环素无法关闭tTA*的效果。四环素存在的情况下，tTA*依旧能和teto启动子结合，开启荧光蛋白基因的表达。这就给已经被标记的神经元留了一条后路，使其仍然能表达目标蛋白。
总结一下tTA*的作用，tTA*使得神经元在不再兴奋时，甚至四环素存在时，依旧持续地使目的基因蛋白表达。一朝开启，永世表达。
这就是Teg-off系统。强力霉素存在时，Tet标记系统关闭。强力霉素缺席(off)时，Tet标记系统开启，兴奋神经元开始表达荧光蛋白。这是Tet-off名字的来源。
Tet标记系统还有另外一个相反的系统，名为Tag-on系统，顾名思义，当四环素存在时，开始标记。其原理跟Tag-off系统类似，唯一不同的点是转录激活因子只有跟四环素结合时，才能结合tetO启动子，开启目标基因的表达。
利用Tet标记系统和即刻早期基因，科学家实现了在特定时间段标记兴奋神经元的理想。实验操作也因为转基因小鼠的存在，变得非常简单。有一种转基因小鼠，自身所有神经元都带有Tet-Tag系统。以Tet-OFF转基因小鼠为例，当科学家不需要标记兴奋神经元时，喂小鼠一日三餐吃强力霉素(doxycycline)。当需要标记兴奋神经元时，断掉小鼠食物中的强力霉素(doxycycline)。
(Tet-off系统：需要标记兴奋神经元时，喂小鼠强力霉素。不需要时，断掉小鼠饮食中的强力霉素。红色闪电表示神经元被兴奋，c-fos启动子被激活)
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