2020年诺贝尔化学奖CRISPR/cas9：科学家如何操纵基因表达？| 基因的敲除和敲入
2020/10/8 0:04:25 生物流BioStream

     2020年诺贝尔化学奖颁给了CRISPR/cas9这一基因编辑工具的发现者。

    

     那么，什么是基因编辑呢？

     基因就像程序员写的程序，不同的程序，运行起来的效果就不一样。程序就是一串串的代码，类似的，基因就是由DNA组成的一串串代码。简单地讲，基因就是四种碱基ATCG不同的排列组合。

     基因编辑，即对基因进行切除、添加、或变换，从而改变DNA的排列顺序。

    

     个体的发育是从一个细胞——受精卵——发育而来，基本上，当时那个受精卵的基因，就是后来发育成的个体的基因。

     也就是说，受精卵通过分裂，一生二，二生四，四生八，八生无数。在此过程中，DNA也在不停复制，分配到新生的细胞中去。所以，我们人体的所有包括皮肤、心肝肺脾、大脑、骨头、血液等器官内的细胞，其基因基本相同。

     如果想要改变整个个体的基因，那就需要从受精卵开始进行基因编辑。如果只是改变局部细胞的基因，那就从局部编辑基因，不需要从受精卵开始。

     基因编辑包括基因的敲除、敲入、变换等，目前最常用的基因编辑工具即CRISPR/Cas系统。

     CRISPR/Cas9敲除技术

     CRISPR，即Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，翻译过来就是规律间隔的成簇短回文序列。而Cas，即CRISPR相关(associated)蛋白；Cas9就是CRISPR相关蛋白9。Cas9是一个核酶，能够切割核酸。CRISPR/Cas9技术也被称为基因的“魔剪”。

    

     作为一个切割DNA的酶，Cas9是如何确定去切割DNA上的哪个基因呢？

     这就需要向导RNA(guide RNA)，也叫gRNA。gRNA是一段单链的RNA序列，可以指导Cas9到达切割的位点。

     首先，gRNA是一段和基因上特定序列互补的一段单链RNA序列，大小约20bp。Ca9能够和gRNA结合在一起，而gRNA能够锚定到特定的基因序列上。因此，gRNA带领Cas9这个酶来到特定的切割位点，切开基因。Cas9像一把剪刀，能够使DNA双链断裂。

    

    

     当基因发生双链断裂时，细胞需要对断裂的基因进行及时修复，否则，基因双链断裂对细胞来说通常是致命的，会引起细胞凋亡。

     细胞如何修复断开的基因呢？通常有两种主要的方式：非同源末端连接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)和同源重组修复(Homologous Directed Repair，HDR)。通过DNA修复，断裂的基因能够重新连接起来。

    

     非同源末端连接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)

     NHEJ是一种快速非精确的DNA修复方式。当基因组发生断裂时，细胞可以通过在断裂位点增加或减少几个碱基，快速将断裂的基因连接起来。由于在修复过程中，基因的碱基发生了变化，减少一个或多个碱基，因此基因的序列就发生了变化。产生突变的基因无法正常表达出蛋白质，就失去了功能。

    

     同源重组修复(Homologous Directed Repair，HDR)

     同源重组修复方式需要一段同源序列作为模板。例如，当一条染色体发生断裂时，同源染色体上相应的片段可以作为同源序列，使断裂的基因重新合成。这种修复方式是精确的，一般不会改变基因的序列。

     当两条染色体同时发生断裂时，细胞没有内源的同源染色体作为模板，就无法进行同源重组修复。此时，非精确的NHEJ是主要的修复方式。如果细胞内没有这种快速的修复方式，那么基因组断裂对于细胞来说就是致命的，修复不好细胞就会走向凋亡。

     NHEJ修复方式会产生突变，产生的突变对物种的进化有一定的贡献。

     通常情况下，NHEJ的修复方式效率更高，更快，但是不精确，会引起基因序列的变化，影响基因功能。相反，HDR的修复方式效率较低，速度较慢，并且需要另一条染色体上的同源序列，但是非常精确，不造成基因序列的变化，基因功能不变。

    

     当gRNA像向导一样带领Cas9来到特定的基因上以后，Cas9切割DNA造成双链断裂，随后，细胞通过内部的修复方式，将断裂的DNA重新连接起来。

     从细胞群体来看，有的细胞会发生NHEJ修复，有的细胞会发生同源重组修复。这时，科学家就需要挑选那些发生了NHEJ修复，基因发生突变的细胞。

     那些使用同源重组修复方式修复DNA断裂口的细胞，基因没有突变，也就没被敲除，这种细胞就不能要。

     当科学家们通过筛选得到那些失去特定基因的细胞时，就完成了一个基因敲除的过程。

     然而，想要敲入基因时，HDR修复方式的细胞则会成为科学家们想要的细胞。

     CRISPR/Cas9敲入技术

     当科学家需要基因敲入时，就必须提供一个外源片段，充当同源重组修复的同源系列。待敲入的目标基因便藏于这一外源片段中。

     Cas9酶在gRNA的引导下，切割目标DNA。随后，DNA修复发生。

     当细胞利用同源重组修复方式，以此片段为模板，在断裂处合成与同源序列互补的基因序列，这样就实现了基因敲入的目的。

    

     同样，细胞群体里仍然会有一部分利用NHEJ修复断裂的DNA链，这些细胞没有实现基因敲入，需要筛选掉。

     总结

     CRISPR/Cas9介导的基因敲除和敲入，高效、精确、价格低廉，是最热门的基因编辑技术，也是诺贝奖的热门候选。除了在DNA上编辑，CRISPR/Cas系统还可以在mRNA上操作，实现基因的敲减，即不影响DNA，只降解mRNA，从而实现功能蛋白的表达量降低。

     (生物流系头条号签约作者)

    源网页  http://weixin.100md.com
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