胶质瘢痕是功是过？——脊髓损伤后神经再生的科研史（3）
2018/6/1 11:04:09 中科院再生医学

     导语

     在脊髓损伤再生修复的研究中，“胶质瘢痕”一直是其中非常重要的研究方向。几十年来，认为胶质瘢痕是“神经再生的物理屏障”，而且“会分泌抑制因子”的传统观念一直占据主流。随着技术的发展和理解的深入，科学研究领域许多传统主流的观念都受到了新生力量的冲击，对胶质瘢痕的认识也不例外。

     本文用生动易懂的文字综述了该领域从20世纪30年代以来对脊髓损伤后瘢痕作用的研究进展及争议，对领域内有影响力的团队发表的成果进行了介绍，相信会给读者一个较为全面的认识。

     本周“脊髓损伤修复前沿”公众号以此为主题进行了专题介绍，如您感兴趣，欢迎关注查看。

     如今，涉及到脊髓损伤、病变及其治疗修复相关的研究论文或评述，大都会谈及胶质瘢痕的产生、形成及其在神经再生与功能修复过程中所扮演的角色。

     长久以来的主流观点认为，成熟的瘢痕应该是阻止神经纤维再生跨越并与原始靶标重新产生神经联系的一道物理屏障。此外，瘢痕组织中分泌的某些外基质分子也被证实具有抑制神经轴突生长的作用。

     因此，自20世纪30年代至今，“瘢痕”在神经再生过程中被主流定性为“负面抑制角色”。但观点争论一直是科研领域的常态与科研发展的动力，对于“瘢痕抑制神经再生”这一传统主流观念的攻守之战，近百年来一直都在上演。

     时至今日，论战虽然未见停歇，甚至愈演愈烈，但人们对瘢痕角色的认识，却在不断深入，越发清晰明朗。事实上，上演了近百年罗生门的不仅仅是瘢痕组织在脊髓损伤修复中的角色。包括影响脊髓损伤后神经再生的主要原因之争，在近百年间也有过数次的变迁。回顾历史或许能让我们更好地梳理和认清许多理论和观念是如何产生，发展，筛选，淘汰，检验，完善、更新进步，直到成熟的。

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    胶质瘢痕是什么？

     其实，胶质瘢痕(glial scar)这个概念一直以来本身就含混不清，目前急需一个明确的界定。脊髓损伤后，损伤部位附近的星形胶质细胞会响应损伤信号而迅速活化为反应性星形胶质细胞(reactive astrocyte)。这类细胞与表达NG2的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells, OPC)和小胶质细胞(micro glia)一起，在损伤组织的附近形成一圈致密的边界结构，将整个损伤区域封闭隔离起来。而被封闭的损伤区内，在炎症反应稳定下来后，聚集有许多不同来源且异质性很强的非神经类型的细胞，具包括与血管伴行的周细胞，脊膜及其他来源的成纤维细胞，间充质细胞，外周血来源的各种免疫细胞等等；此外，也有研究表明脊髓室管膜细胞响应损伤后增殖产生的GFAP阴性的星形胶质细胞也会出现在损伤核心区内(图1)。

     因此，瘢痕组织的形成是一个进行性的，时间和成分上动态变化的过程。而胶质瘢痕这个词，许多年以来一直混指整个由几类胶质细胞形成的致密边界及其包裹的损伤核心区域。但是，损伤核心区域内神经细胞只占极其有限的一小部分，甚至在有些损伤模型中几乎检测不到其存在。基于此，有许多研究人员将损伤核心损伤区域内的瘢痕组织称为纤维性瘢痕(fibrotic scar)或者间质性瘢痕(stromal scar)。而真正的胶质瘢痕应该是指损伤核心区外围形成致密隔离作用的、数个细胞厚度的、胶质类细胞聚合结构(图1)。

    

     图1. 瘢痕组织的结构 (Katrina L. Adams&Vittorio Gallo， Nature Neuroscience， 2018 有修改)

     近十多年来，胶质细胞在中枢神经系统中生理功能的异质性和复杂性已有了深入的研究。由此，我们不难想象，胶质瘢痕内包含的几类胶质细胞亦是复杂多样，有别于各自常态下的特征的，更不必说纤维性瘢痕所在的损伤核心区还存在内众多不同类型的细胞。这也暗示我们对瘢痕组织在神经再生过程中的功能和角色的定位可能需要进行更加复杂深入的研究和全面综合的考量。

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    胶质瘢痕是物理屏障源自臆测？

     20世纪初，天才的现代神经科学之父Santiago Ramóny Cajal根据著名的外周神经移植物能诱导中枢神经细胞的神经轴突再生长入实验，提出了趋化因子理论(Cajal’s chemotactism theory)来解释中枢神经系统再生困难的原因。他认为，中枢神经系统在损伤后可能是存在或者缺乏某种对神经纤维再生必不可少的相关趋化因子(图2)。

    

     图2. Cajal及其中枢神经轴突再生理论

     到了20世纪40-50年代，有一些研究人员开始观察到，损伤后的轴突总是无法再生穿越上述由损伤后形成的结缔组织样的胶质瘢痕区域，而且许多神经轴突似乎就停止在胶质瘢痕的边缘，根本无法长入。由此，人们难免推测很可能是致密的瘢痕组织本身形成了一个阻碍轴突穿越再生的物理障碍。

     1954年，Clemente及合作者的研究表明，用药物抑制损伤部位胶质瘢痕的形成，能观察到更多地神经轴突再生及脊髓损伤后猫的行为学改善。这篇文章的结果将胶质瘢痕视为物理屏障的观点推向高潮，人们甚至开始一度摒弃Cajal的早期趋化假说。

     新的科研成果和观点总是要经得起推敲和重复。毕竟Cajal名声在外，拥护和崇拜者也不乏其人。就在上述论文发表的第二年，就有人在同一期刊登文，称其报道的再生结果及功能恢复无法验证。二十多年之后的1979年，还有人在重复这一实验结果，遗憾的是，同样也无法重复出阳性结果(图3)。但是，瘢痕组织是神经再生物理障碍的观点并没有偃旗息鼓，可能是这种观点太直观明了，浅显易懂。

    

     图3. 上文中提及的两篇反对论文

     上世纪80年代之前，受限于落后的细胞研究技术和实验分析手段，并没有太多令人信服的实验来多角度验证胶质瘢痕作为神经轴突再生障碍的科学性。直到1990s以后，随着手术精细程度的提升，分离鉴定手段的进步，显微观察示踪技术的发展，围绕胶质瘢痕的研究也在不断向前推进。自1990s至今，人们对胶质瘢痕作为再生障碍的认识已远超过去数十年的累积，瘢痕的作用的认识在不断更新，修正与深化。

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    胶质瘢痕分泌的CSPGs是抑制性的Cajal趋化因素之一

     随着蛋白质分离纯化鉴定技术的不断进展，自Cajal的理论提出至上世纪80-90年代，虽然经过数代科研人员的努力都未能筛选和寻找到中枢神经系统中有利再生的因素(内因挖掘在基因操作尚不成熟的时期肯定是困难巨大)，但是却陆续发现了不少起抑制作用的蛋白因素，如Nogo，MBP和Omgp等(Martin Schwab实验室引领了1980s-2000s时期脊髓损伤修复领域以外界抑制因素为主要归因的研究高潮，详情请参见本公众号之前推送的文章“追“古”烁今——脊髓损伤后神经再生的科研史(1)”。

     在这段时期，瘢痕组织中由反应性星形胶质细胞及其他细胞大量表达的细胞外基质分子硫酸软骨素蛋白聚糖类(CSPGs)被视为是主要影响轴突再生的抑制因素之一。

     1991年，凯斯西储大学Jerry Silver实验室通过体外实验表明脊髓损伤后瘢痕组织中反应性星形胶质细胞来源的CSPGs在体外能抑制神经轴突的生长，暗示其在体内可能的神经再生抑制作用。之后，剑桥大学国王学院JamesFawcett实验室表明通过施加硫酸软骨素酶ABC(ChABC)消化损伤区瘢痕组织内CSPGs分子使其失去活性，可以有效促进脊髓损伤动物的运动功能恢复，而且他们还观察到损伤部位附近明显的神经轴突出芽再生。此后，Fawcett一直致力于ChABC治疗脊髓损伤的临床推广。而后续的许多研究也较好地重复验证了ChABC在治疗脊髓损伤上的效果。

     最近，Silver实验室的研究结果还显示：当轴突中的蛋白酪氨酸磷酸酶σ(PTPσ)与胶质瘢痕中硫酸软骨素蛋白聚醣相互作用时，会阻止轴突生长。他们设计了名为ISP的拮抗剂来阻断PTPσ与CSPG的结合，皮下注射该药物后能使脊髓损伤的瘫痪小鼠恢复轴突再生并可有效改善运动和膀胱功能。此外，还有些其它研究团队证明CSPG能在体内和体外直接影响少突胶质细胞的成熟及神经轴突的再髓鞘化。

     基于以上许多累积的数据，传统观点得到肯定和发展：胶质瘢痕及其分泌物CSPGs可能通过本身形成物理屏障，以及通过某种抑制信号导致轴突再生障碍和再生轴突的再髓鞘化障碍，从而抑制脊髓损伤后神经功能再生。

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    为胶质瘢痕及CSPGs抑制角色的抗辩

     一波未平，一波又起。由1950s年代兴起的胶质瘢痕是否为轴突再生的物理屏障之争在1990s之后还未平息，CSPGs作为瘢痕分泌的外基质成分，是否是轴突难以穿过瘢痕并再生的原因的争议愈演愈烈。

     否认抑制角色观点的研究人员认为，无论是CSPGs的酶切消化还是对其信号通路的衰减，虽然检测到一定的神经功能恢复，却并没有体内确切证据显示运动神经纤维能跨越瘢痕组织进行长距离再生。

     此外，CSPGs在体内抑制神经轴突再生的结论也不是一成不变的。加州大学圣迭戈分校的Mark Tuszynski教授团队发现，部分轴突可以再生进入共表达NG2 (CSPGs成员之一) 及L1和Laminin或NCAM的瘢痕组织内(后三者为细胞黏附因子，被视作轴突生长促进因子)，暗示损伤部位抑制因素和促进因素的博弈和平衡或许对部分类型的神经轴突的再生有调节作用。事实上，体内损伤微环境异常复杂多样，只单纯存在CSPGs对神经轴突起作用的几率是几乎不存在的。因此，最终能观察到何种轴突再生的结果很可能是轴突所处的损伤微环境里多种成分和因素共同存在并且相互博弈取得的某种平衡所致。

     长久以来，一直对胶质瘢痕及其分泌外基质CSPGs在轴突再生方面的负面调控角色持怀疑态度的领军人物要数加州大学洛杉矶分校的Micheal Sofroniew教授领衔的团队。

     2016年，该团队通过遗传手段特异去除成年小鼠脊髓内具有瘢痕形成能力的反应性星形胶质细胞的增殖能力，使其可以在脊髓损伤后特异的阻碍胶质瘢痕形成。通过观察这些小鼠脊髓损伤后急性及慢性期时三种中枢神经系统中不同类型上下行神经轴突的再生情况及总体CSPGs水平，研究者发现，减少形成瘢痕的星形胶质细胞，虽然可以有效阻止胶质瘢痕的形成，但是无论阻碍急性期胶质瘢痕形成还是慢性胶质瘢痕形成，都不能有效引导神经纤维再生进入损伤区内，同时反应性星形胶质细胞的增殖与否对CSPGs的沉积并无显著影响。此结果以极为煽动和颠覆性的标题“Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration(星形胶质瘢痕的形成促进中枢神经系统轴突再生)”在Nature杂志发表。配合此文发表的，还有由胶质细胞研究领域的翘楚，斯坦福大学知名教授Ben Barres在同期Nature杂志配发的宣传文，题为“Not everything is scary about a glial scar”。

     此文一出，立即引发不小的震动。瘢痕研究的大佬Silver随后在Experiment Neurology撰文，对上述Nature文章提出见解与异议。作者认为，虽然减少星形胶质瘢痕的脊髓损伤大鼠中观察不到皮质脊髓束的再生，但未对星形胶质瘢痕做处理的对照组也并未见到有效的皮质脊髓束再生，因此，标题开宗明义说星形胶质瘢痕形成有助于轴突再生本身就有夸张宣传的嫌疑。另外，急性期内减少瘢痕形成反而使得轴突再生情况变差，可能是由于反应性星形胶质细胞数量改变引起了免疫反应的改变而导致的结果。

     瘢痕组织的成分原本就是复杂的，试图通过单一去掉某种细胞去衡量其在损伤修复中的作用，原本就是武断和过于理想化的，最终结果可能与现实情况差异甚大；其次，瘢痕组织的组分及从急性到慢性期的形成过程应该是动态变化的，因此，瘢痕组织对神经纤维再生的影响随时间和具体环境而扮演辩证的角色。所以，部分研究者认为胶质瘢痕在早期很可能对轴突再生是有益的，而陈旧性的胶质瘢痕可能主要对轴突再生起到障碍和抑制作用。

     中国科学院戴建武团队近日发表在Experimental Neurology杂志的文章支持了这一观点。他们分别分离了脊髓全横断损伤后2周及8周大鼠的瘢痕组织，对亚急性期和陈旧性期的瘢痕组织进行蛋白质组学分析。结果显示，2周形成的瘢痕组织中含有更多的营养因子，而fibrolectin等外基质的分泌则在8周形成的瘢痕组织中更多，提示亚急性期与陈旧性期的瘢痕组织在蛋白质表达上存在差异。此外，日本九州大学Seiji Okada研究团队通过在脊髓损伤2周后以药物特异性抑制integrin信号来衰减胶质瘢痕的形成，也可以观察到明显改善的行为学水平。

     在上文提及的Sofroniew的Nature文章中，5周后处理瘢痕组织未能观察到明显的上行感觉神经纤维的再生，这一点与Seiji Okada研究团队的结果有所出入。但是，戴建武团队的研究结果显示，在8周手术清除瘢痕组织后，上行感觉纤维的再生得到了明显增强，同时，清除瘢痕组织后，在损伤处给与多种神经营养因子能更有效地诱导上行感觉纤维的再生，暗示陈旧性瘢痕组织的存在可能确实影响了神经轴突的再生。

     早在2015年1月，戴建武再生医学团队就已经在国际上首次开展了神经再生胶原支架移植治疗陈旧性完全性脊髓损伤的临床研究。他们通过损伤部位原位电生理检测来区分神经电生理传导的响应区域与非响应区域，并首次在术中对陈旧性脊髓损伤患者损伤部位无神经传导活性的瘢痕组织的清理。随后，他们在瘢痕组织清除区域移植了其自主研发的神经再生胶原支架。首批5例患者经过1年的安全性评估未发现与瘢痕清理和神经再生胶原支架移植相关的不良反应，证明产品及治疗方案的安全性，这是国际上首次功能胶原支架应用于患者的临床研究。

     目前，戴建武团队已完成60余例陈旧性患者的移植手术，部分患者出现植物神经功能或感觉平面扩展等效果，证实陈旧性瘢痕组织的存在可能确实影响了神经功能恢复，而科学清除陈旧性瘢痕组织可以有效改善患者的感觉及运动功能。除陈旧性脊髓损伤患者外，该团队还首次招募了急性完全性脊髓损伤受试者。首批4例患者手术六个月后均出现运动功能改善。其中1例颈段损伤患者和1例胸段脊髓损伤患者出现较准确的大小便感觉，下肢出现自主的运动功能恢复并伴随有中断的感觉诱发电位和运动诱发电位的恢复，提示神经再生支架和治疗方案具有疗效。

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    纤维性瘢痕及其作用

     除了胶质瘢痕外，损伤核心区域还存在另一类瘢痕——纤维性瘢痕，其在损伤修复中的作用也是复杂多样，利弊兼具的。最早通过遗传标记系统阐述脊髓组织内血管伴生的周细胞(pericyte)能在脊髓损伤后增殖并迁移到损伤区，且是纤维性瘢痕的重要来源的，是瑞典卡洛琳斯卡学院杰出神经生物学家Jonas Frisén领导的团队。

     他们通过特异谱系示踪周细胞的小鼠(Glast-CreER)与Ras缺失型的小鼠杂交，繁育出了可特异阻断A型周细胞增殖能力的工具鼠。对该工具鼠实施脊髓背索损伤后，与野生型小鼠不同的是，原本能在损伤后大量增殖并迁移到损伤区的周细胞并未活化，导致损伤区留下了或大或小的空洞，伤口无法闭合。该研究表明，A型周细胞在脊髓损伤后能很好地促进损伤区的愈合，并能阻止伤口进一步扩大化。事实上，周细胞增殖活化所引起的瘢痕形成不仅在中枢神经系统，很可能在其它器官中也具有类似的作用，它们的活化或许是对损伤的一个普遍反应。

     就在Sofroniew团队在Nature发表上文提及的文章之后，Jonas Frisén团队用同样的工具鼠和损伤模型，来观察纤维性瘢痕的衰减除了不利于早期脊髓损伤处组织的止损之外，在功能修复过程中是否像胶质瘢痕一样还有另一层作用。他们的结果表明，在优化周细胞衰减程度(即既不会造成早期巨大的空洞形成，又有效减少了周细胞的增殖数量)的情况下，多种运动相关的长纤维能有明显的再生，并在再生部位产生神经联系，同时动物的运动功能得到显著提升。这说明适度衰减纤维性瘢痕组织的沉积能有效促进脊髓损伤后功能恢复。

     当然，他们的结果也难免有所争议，例如对周细胞增殖程度的准确拿捏(过度抑制增殖则损伤无法不能闭合，形成开放性损伤)，以及Glast作为谱系示踪的准确程度等等之类的。

    

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    目前能总结的话

     瘢痕组织及其分泌蛋白CSPGs在脊髓损伤后所扮演的角色已经争论了将近百年，在科学研究中，出现分歧在所难免，产生争辩也是无可厚非，这原本是推动科学进步的有效动力之一。相信随着科技的进步和研究的深入，用科学，动态和辩证的眼光去分析瘢痕组织及其在神经再生过程中的角色，会使对瘢痕的定位和认知越发清晰与合理。同时，这样的认知也将有效助力脊髓损伤修复这一世界难题的早日攻克。

     主要参考文献：

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     Barres是神经胶质细胞研究领域的开拓者和集大成者。有文章对他的描述称：“Barres身材矮小、秃顶、胡子稀疏，喜欢穿工装裤，是一个很安静的人”。很多人并不知道，“他”其实原来是“她”。

     Barres原名叫芭芭拉·巴雷斯(Barbara Barres)，虽然生为女性，但她从小就认定自己是个男人。在其41岁罹患乳腺癌进行了乳房切除手术后两年，她毅然进行了变性手术。此后，芭芭拉·巴雷斯变成了本·巴雷斯。促使她决定变性的原因，除了发自内心的男性自我认同之外，还源于长期以来外界对于她作为一个女性从事科研工作的种种歧视。据说她曾经在MIT课堂上解出一道很难的数学题，而且全班只有她一个人解了出来，但是教授认为可能“是男朋友帮了忙吧”。然而，芭芭拉并没有男朋友。此外，在某次竞争奖学金之时，芭芭虽然已经发表了六篇论文，却还是输给了一个只发表了一篇论文的同学，只因那是一位男同学。从业之后，一次他做完一个科学报告后在台下走动时，无意间听到一个听众对别人说：“本巴雷斯的这个报告真不错，比他妹妹芭芭拉强多了”，殊不知，之前的芭芭拉就是此刻的本。变性之后，本在科学界里被人“更当回事”了，仅仅因为他现在是个男人。

     2013年，因为在神经胶质细胞上的杰出研究成就，巴雷斯当选美国科学院院士，他是第一位变性院士。个人的成长经历也让本经常为女性以及LGBT平权发声。此外，他并没有组建自己的家庭，而是将精力都投入到科学研究上。他对待学生也十分真诚开明，多次撰写文章要学生注意如何选择导师。

     2017年12月27日，巴雷斯因胰腺癌去世，享年63岁。斯坦福大学发布的悼文里说，在最后的日子里，他忙于为学生们撰写推荐信，也写文章呼吁导师给博士后更多地科研自由。有些人的存在，让这个世界变得更好了一点。他的存在，也让科研圈也变得更温馨了一点。

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     编辑：李佳音

    

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