中国器审：循环肿瘤DNA（ctDNA）检测研究进展概要
2018/4/19 15:13:27 功能医学与荷尔蒙
近日，美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理学家协会(CAP)组织了专家委员会联合对已经发表的临床ctDNA检测的论文进行了综述分析，该文较为全面的总结了ctDNA(循环肿瘤DNA)检测当前的研究状况以及需要进一步解决的问题，也为未来的研究提供了框架性建议，更好地指引和规范了ctDNA检测技术的发展和应用。
一、背景介绍
液体活检技术是指对血液等体液标本进行诊断分析，其具有取样便捷、微创、便于实现动态监测、能更完整的反应肿瘤基因信息，克服单一病灶取样的空间限制等优势。其中，检测血液ctDNA是目前液体活检领域发展最快的检测方法。
通过文献检索搜索了1338份ctDNA检测相关的临床文献，最终筛选出77篇文章汇总分析。并主要针对实体瘤中ctDNA突变以及DNA序列或拷贝数变异情况，分别从样本前处理、分析有效性、结果解读和报告、临床有效性和实用性几个方面进行了分析总结，主要内容如下：
二、样本前处理
在ctDNA检测样本前处理步骤中存在众多不确定因素，而这些变量可能会影响样本质量、DNA的提取等，从而影响后续的检测评价。
目前研究表明最佳的样本类型是血浆，且最好采用含细胞稳定剂的抗凝管或EDTA抗凝管采集血液。采用EDTA抗凝管时，应在采样后6小时内尽快处理，分离血浆。该过程中应尽可能降低白细胞溶解产生的大量细胞游离DNA对ctDNA的稀释影响。
整体而言，在样本抽血、采集、处理、储存、运输、DNA提取纯化等步骤中存在诸多可能影响后续检测的因素。此外，患者相关的生物学因素也可能会影响患者血液中游离DNA的释放，如吸烟、贫血、炎症类非恶性疾病、自身免疫性疾病等。而目前这方面的研究还很有限，诸多问题尚待解决。
三、分析有效性
分析有效性指能准确、可靠地检出突变的能力，包括准确性、灵敏度、特异性、重复性等。目前，评价血浆ctDNA检测准确性和特异性的方法主要是通过与配对组织样本检测进行方法学比对。研究表明，血浆ctDNA检测与组织检测存在不一致情况，该情况除了受到分析性能(如分析灵敏度)的影响，也可能是其他生物学因素引起的，如癌症类别、肿瘤分期、肿瘤空间和时间的异质性、组织血浆取样时间差等。
由于血浆中ctDNA含量较低，对于检测下限的研究很重要，考虑到上述生物学因素可能的影响，建议纳入细胞系或人工构建的标准化的样本，对检测限附近的检出能力进行研究验证。目前，不同突变类型的最佳检测下限还未进行系统性研究，该检测限也可能将根据预期用途而变化。
此外，当前不同的ctDNA检测能力存在差别，未来的研究应考虑进行更多大型的跨平台比对研究。同时，下一步应综合考虑样本前处理和分析检测中的变量开展研究，确保检测质量。最后，建议应根据预期用途研究建立ctDNA检测最低的分析灵敏度和特异性，以促进其临床应用。
四、结果解读和报告
ctDNA检测结果的解读面临着一些特有的挑战，尤其应注意以下几点：
(1)当ctDNA检测报告显示对某一特定基因突变可以采取治疗措施时，建议将该检测结果与其他临床信息、肿瘤分析的信息进行整合，阐述与治疗方案间的整体相关性。在可检测胚系突变的应用中，注意对于模棱两可的结果，或可能是胚系突变的结果进行后续的检测和解读。
(2)对意义不明的克隆性造血情形中的基因突变应谨慎解读。
(3)不同患者中ctDNA占总细胞游离DNA的比例差异较大，不同样本前处理过程得到的样本中白细胞释放的游离DNA也不尽相同，需要进一步研究ctDNA检测的基因突变丰度的预后意义。
(4)ctDNA检测结果可能与组织检测结果不一致，考虑到释放在血浆中的ctDNA含量通常较低，尤其是在中枢神经系统癌症中血脑屏障的影响可能较大，因此对于未检出结果要进行谨慎解读和说明。
五、临床有效性和实用性
文章根据ctDNA检测不同的预期用途，从以下几个方面展开，主要关注了在转移性癌症中的应用。
(一)应用于晚期癌症中的治疗方案选择
ctDNA检测在该方面应用的研究相对较多，目前也有获批的基于PCR技术检测非小细胞肺癌患者中的EGFR突变状况的产品。其临床实用性主要是通过对之前的临床试验中获得的样本进行回顾性检测分析得到的。其中，需要特别注意的是，由于存在部分假阴性结果，尤其是在T790检测情形中，对未检出的结果应尽可能通过后续的组织检测进行确认。
此外，由于晚期癌症中存在肿瘤异质性，ctDNA可能是来自所有的转移部位，而组织检测通常是在单一转移部位或原发病灶处进行的。高灵敏度的ctDNA检测可能检测到亚克隆突变，在不同情形中，亚克隆突变可能的影响还值得进一步研究。
整体而言，除了已获得监管部门批准的检测外，大多数检测方法还没有充分证据表明其临床有效性，并且大都不具有临床实用性证据，接下来的研究应尽可能纳入与预期人群接近的患者，同时样本要经过严格的质控，开展前瞻性的临床研究充分验证其临床意义。
(二)应用于疗效监测
ctDNA检测应用于疗效监测时，主要是定量检测ctDNA随时间变化的情况。然而在该过程还存在诸多挑战，包括考虑样本前处理和分析过程的有效性和可重复性的影响，需要研究验证不同实验室结果间的可互换性问题，建立量化DNA负荷的最佳单位等。
尽管在少量的研究中建立了ctDNA水平与治疗反馈间的关系，但目前该应用的临床有效性证据尚不足，也缺乏有力的临床实用性证据，需要进行进一步严格设计的临床研究。
(三)应用于残留病灶的检测
尽管理论上在患者接受手术等根治性治疗后，可根据ctDNA的变化情况来检测残留肿瘤组织，以在早期阶段诊断或辅助判断癌症复发情况。然而目前尚无证据表明ctDNA可达到类似于白血病管理中的微小残留病灶检测能力，而且该方面的研究大都是回顾性的，其检测的假阴性率和假阳性率还未确定，临床有效性证据有限，临床实用性也尚不明确，建议未来进行前瞻性随机研究。
(四)应用于无症状人群的肿瘤筛查
考虑到可以在早期癌症患者中检测到ctDNA，但其含量通常较低，该检测在无症状人群的癌症筛查方面的应用备受关注。但目前对于实体瘤领域，还缺乏相关有效的临床有效性和临床实用性证据，对于检测假阳性(包括检测技术上和生物学因素)的程度也尚不明确。
六、结论
尽管ctDNA检测在肿瘤诊疗领域显示出诸多优势，但目前该技术在样本前处理、分析性能、临床有效性和临床实用性方面还有诸多待研究的问题，尤其在临床有效性和临床实用性证据方面，除了个别已批准的产品在一定程度上表明了其临床用途外，大多数用于癌症筛查、治疗方案选择、疗效监测、残留病灶检测领域的检测都缺乏有力的临床证据，现阶段不宜在临床广泛开展，接下来的研究中应尽可能纳入所有可能的预期人群类型，通过严格设计的临床研究来充分验证其临床意义。
参考文献：
[1] Merker J D, Oxnard G R, Compton C, et al. Circulating Tumor DNA Analysis in Patients With Cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists Joint Review[J]. Journal of clinical oncology, 2018: JCO2017768671.
[2] Oxnard G R, Thress K S, Alden R S, et al. Association between plasma genotyping and outcomes of treatment with osimertinib (AZD9291) in advanced non–small-cell lung cancer[J]. Journal of clinical oncology, 2016, 34(28): 3375.
[3] 吴一龙，等. 液体活检：规范与精准同行[J]. 循证医学，2016,16(4)：193-197.
[4] 刘毅，张少华，吴一龙，等. 中国临床肿瘤学进展[M]. 人民卫生出版社，2017:435-437.
审评六部 史裕英 傅继欢 吴传松 安娟娟供稿
延伸阅读
随着精准医学概念的提出，精准医学已经逐渐被人群接受，肿瘤便是精准医学首要解决任务之一。说起肿瘤、癌症，已经不再像多年前一样让谈癌色变，但仍旧为人们所恐惧。成功治疗肿瘤还是以早发现早治疗为主。那么尽早检测和发现肿瘤便是首当其冲的核心。液体活检(Liquid biopsy)的检测方法，可以捕获到进入血液的其它细胞或DNA，从而替代了疾病的诊断，例如肿瘤。最近比较火热的液体活检有：cfDNA、ctDNA和CTC的检测。
关于cfDNA
首先，cfDNA是什么？其实就是血液中游离的DNA片段。外周血中的cfDNA的含量能说明什么？有研究已经证实，肿瘤患者外周血中的cfDNA总量，要高于健康人。通过这一点，虽然不能武断的说cfDNA能成为肿瘤标志物，但是cfDNA的含量增多，能起到一个较好的提示作用，作为一个初筛的手段。基于cfDNA的液态活检中，尽管ctDNA在肿瘤诊疗中的应用是当下cfDNA最广泛，研究最深入的分支。但是，cfDNA作为液态活检，不只是局限于肿瘤学。例如，有研究报道对于接受器官移植手术的病人，可以通过监测术后外周血中具有捐献者基因特征，片段化的cfDNA含量变化，来评估移植器官的排斥情况。在无创产前基因检测中，采集孕妇外周血(5ml)，提取游离DNA，采用新一代高通量测序技术，结合生物信息分析，得出胎儿是否存在基因异常情况，如患染色体非整倍体(21-三体又称唐氏综合征，18-三体，13-三体)的风险。
关于ctDNA
ctDNA，即循环肿瘤DNA片段。ctDNA主要是死亡的肿瘤细胞破裂后所释放出来的、片段化的基因组DNA。理论上，所有的肿瘤都会产生ctDNA。ctDNA中能够检测到的遗传变异信息非常丰富，从简单的点突变到复杂的结构变异(structural variation)，甚至染色体拷贝数变异都能够检测到。但是，ctDNA的检出率是高度依赖于肿瘤发展阶段、肿瘤类型和检测手段这三个重要因素。
至于为什么肿瘤细胞会将DNA释放到血液中呢？科学家给出了三种主要的解释：1、来自于坏死的肿瘤细胞；2、来自于凋亡的肿瘤细胞；3、来自于肿瘤细胞分泌的外排体。但是还有一些问题尚未明确，如循环肿瘤细胞是否也释放了部分ctDNA，这三种来源对于ctDNA的贡献比例是怎样的等等。
肿瘤发展阶段上，ctDNA含量通常在晚期或转移性肿瘤中较高，而在早期或局限性肿瘤中含量较低。在不同类型肿瘤中，ctDNA水平也存在差异。研究人员发现，在640例患者中，ctDNA可检测超过75%的晚期胰腺癌，卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌，以及头颈癌。然而，在原发性脑、肾、前列腺癌和甲状腺癌的检测却不到50%。
目前，ctDNA可以作为肿瘤预后的标志物，而且也能够用来预测药物治疗的效果，这也是ctDNA作为肿瘤监测应用非常重要的一个方面。
关于CTC
CTC，即循环肿瘤细胞 (Circulating tumor cell, CTC) ，是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。
1889年，Paget提出了“种子和土壤”的学说，强调癌细胞和微环境之间的关系，认为肿瘤转移的形成，是处于旺盛生长状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到合适的器官、组织的基质环境，即“土壤”时，就会发生肿瘤的转移。期间，有专家提出了“解剖--机械”学说，认为CTC的转移为随机现象，CTC在最先到达脏器的毛细血管或淋巴结发生机械性滞留。在1896年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，并率先提出了CTC的概念。从上世纪末以来CTC检测技术得到了不断的改进，随之带来的是CTC检测在临床的应用。
目前FDA认证的CTC应用，主要是指通过CellSearch平台的CTC计数来辅助评估转移性乳腺癌、转移性前列腺癌和转移性结直肠癌的疾病进展，主要包含以下几个方面：
1、接受化疗的癌症患者基线的CTC数量(Cut-off值：乳腺癌/前列腺癌是5个CTC/7.5ml血，结直肠癌是3个CTC细胞/7.5ml血)，可预测治疗后无进展生存时间和总生存时间，以此作为患者是否需要接受辅助化疗的参考；
2、接受化疗的癌症患者CTC的数量变化，可预测治疗后的无进展生存时间和总生存时间，以此作为肿瘤进展、转移复发风险评估的参考；
3、接受化疗的癌症患者CTC数量，可用于实时反映肿瘤负荷，以此作为肿瘤药物耐药性的监测。
研究表明，在极少数肿瘤高危人群中的确能够检测出CTC，能够很准确地提示肿瘤的发生，并且远早于影像学证据。
CTC在肿瘤早期筛查/诊断中的难点在于：
1、CTC在肿瘤患者外周血中含量很低，在癌前病变或肿瘤早期数目更加稀少。一般患者10ml血中只有1-10个CTC，而 10ml血液里面有500亿个红细胞和上亿白细胞，以及多种的稀有细胞，比如巨核细胞、内皮细胞，未成熟的造血细胞，上皮细胞等，这些细胞在正常血液中很少见到，但在癌症患者的血液中容易被误认为CTC。这对应用于肿瘤早期筛查/诊断的CTC检测技术，提出了更高的要求。
2、CTC应用于肿瘤早筛，较多的基于特定类型肿瘤的高危人群(例如慢性阻塞性肺病和肺癌)开展分析和相应推论。但就检测到CTC所选取的特征值(如数量，CD45抗原阴性，EpCAM阳性，特定肿瘤基因突变等)，只能推断这种细胞可能是恶性肿瘤细胞，而不能进一步确诊为何种肿瘤细胞。未来的研究，应进一步完善单细胞水平上肿瘤类型的区别性诊断方案。
总得来说，普通健康人中cfDNA含量低，超过90%的健康个体每毫升血浆中的cfDNA量不超过25ng，而患者的cfDNA水平是健康人的数倍。ctDNA的灵敏度高于CTC，但针对肿瘤早期筛查或诊断，CTC的准确性优于ctDNA。来源：罗辑医疗
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