研究过程及感悟—白血病耐药的基因组演化历程和治疗策略
2018/4/3 中国科学院北京基因组研究所
谈起肿瘤，给人第一印象就是生存能力强，从细胞层次上来说，其实就是肿瘤细胞增殖能力和抵抗能力相当顽强；而从分子层次上讲，就是肿瘤细胞内调控细胞增殖的各级分子信号通路的异常，进而导致肿瘤细胞的恶性增殖。在生物科学和医学的研究中，酪氨酸激酶能够磷酸化(催化)各种与细胞增殖相关的蛋白分子，使之活化，进而引起肿瘤的发生。因此，抑制酪氨酸激酶激酶活性在一定程度上能够抑制肿瘤细胞的生长。
酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是人类历史上第一个成功的靶向治疗药物，成功的将慢性粒细胞性白血病患者的长期预后生存率提高到了90%以上，以其卓越的疗效，成为靶向药物治疗恶性肿瘤的典范。然而以往多项研究发现，慢性粒细胞性白血病患者病人体内的肿瘤细胞的由于基因突变，不断产生对该抑制剂的耐药性(抵抗性)，并且成为是临床的重大难题。近年来，临床上发现该药物也可用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)，因此我们不禁要问：TKI在治疗急性淋巴细胞白血病的过程中是否也会像在治疗慢性粒细胞性白血病那样产生耐药性呢？如果出现耐药性，耐药机制又是什么呢？
针对以上这两个问题，中国科学院北京基因组研究所刘欣研究组与中国医学科学院血液病医院竺晓凡团队以及美国St.Jude儿童研究医院杨俊团队合作，对一例急性淋巴细胞白血病的患儿使用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗的案例进行了深入研究。该患儿在服用TKI症状获得缓解后，半年后却又产生耐药，证实TKI治疗急性淋巴细胞白血病的耐药性确实存在；另外，我们的研究发现耐药产生的机制是“由于病人肿瘤细胞内发生基因突变，导致了对TKI的耐药性”，最后，针对耐药产生的机制，我们提出了克服耐药的方案。
研究过程如下：
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首先，我们探索该病人为什么得白血病。通过对其初诊、化疗耐药、TKI耐药三个时间点的样本进行转录组测序。分析发现该病人携带一种新的致病融合基因(AGGF1-PDGFRB)，功能实验也证实了其致病性(图1)。说明病人由于携带AGGF1-PDGFRB异常，使肿瘤细胞内通路异常激活，肿瘤细胞持续恶性增殖，最终患儿罹患白血病。
图1 新致病融合基因AGGF1-PDGFRB的示意图及功能实验证实其致病性
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其次，患儿治疗过程中，基因组上有什么变化，导致了TKI耐药？我们过对病人初诊、化疗耐药、TKI耐药三个时间点的样本进行全基因组测序分析，刻画了该病人的基因组突变谱，以及疾病进程中的克隆演化(图2)，发现PDGFRB点突变在TKI治疗过程中特异出现，并使白血病细胞获得生长优势，成长为TKI耐药复发时的主克隆。这提示我们肿瘤细胞很有可能是因为获得了PDGFRB点突变而导致了TKI的耐药。为了验证PDGFRB突变是否确实能导致TKI耐药，我们使用细胞来进行验证，以常见的PDGFRB融合EBF1-PDGFRB为阳性对照，使用TKI分别处理携带突变和未携带突变的细胞系。观察发现携带突变的细胞系对药物耐受能力明显增强(图3A)。这直接证明肿瘤细胞获得PDGFRB突变后，可直接导致TKI耐药。
图2 疾病过程中的克隆结构及克隆演化模型
PDGFRB点突变可以导致病人TKI耐药，那么，如何才能帮助病人克服该耐药性呢？由于PDGFRB主要下游通路为JAK-STAT通路，我们尝试使用广谱JAK抑制剂CHZ868分别处理携带突变和未携带突变的细胞系，发现无论突变与否，细胞对该抑制剂敏感性无差异(图3B)，这提示CHZ868可能是一种治疗该类耐药病人的潜在治疗手段。
图3 细胞功能实验证明PDGFRB点突变可直接导致TKI耐药，CHZ868是可逆转该耐药表型的潜在治疗手段
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最后，我们从结构上解释了为什么CHZ868可以克服TKI耐药。我们模拟了PDGFRB的激酶结构域的三级结构，发现PDGFRB突变后，TKI则不能与突变后的PDGFRB蛋白结合；而CHZ868则可与PDGFRB蛋白产生更多的代偿性互作，使得抑制剂CHZ868能在点突变后继续有效(图4)。
图4 蛋白结构模型揭示PDGFRB点突变直接导致酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药，小分子抑制剂CHZ868是潜在的治疗新策略
通过以上研究，揭示了急性淋巴细胞白血病新的致病原因、新的TKI耐药机制，并为该类耐药病人提出潜在的治疗策略。研究也提示我们靶向药物的耐药和治疗过程中的基因组演化有关，融合基因或点突变的出现都可能影响药物的治疗效果；而针对不同的基因组异常，可给予针对性的治疗措施以逆转耐药。这些发现有助于推动科研人员及临床医生进一步了解靶向药物，为更好地推动精准治疗、造福病人打下良好的基础。
个人感悟
本课题从开始立项到最终成文，大约经历了三年时光，课题进展中遇到过种种瓶颈期，也经历了每次突破瓶颈期的喜悦：
首先课题的主要科学问题的凝练：开始时，我们提出了很多问题， “化疗耐药的原因”及“TKI耐药机制”等，我犹如“盲人摸象”般做了很多文献调研，背景知识不能自成系统，提炼不出课题的背景和意义，幸运地是导师刘欣老师和王前飞老师的一直耐心点拨，才让我更快地掌握体会到课题的“有趣”；其次，在全基因组分析出很多个突变基因后，我难以从中挑选出哪一个和TKI耐药相关，期间老师找我多次从已有文献、蛋白结构、功能等各方面入手讨论，尝试了靶向测序、ddPCR等多种方法，最终排除种种因素后，才敲定PDGFRB点突变；之后，我们满怀欣喜地开始着手实验验证，然而在验证融合基因AGGF1-PDGFRB的致病性时，连续三次结果均为阴性，接近半年的时间，无论怎么改变实验条件，实验结果总是让我们失望，这让我多次怀疑前期将目光放在PDGFRB点突变上是对是错，怀疑这个课题是否还能继续。不过，功夫不负有心人，在我们坚持了大半年后，终于迎来了曙光，AGGF1-PDGFRB的致病性得到验证后，后期的TKI耐药实验一气呵成，几个月内就全部顺利达到预期。
回首这几年，我的心情起起伏伏，但最大的感慨，也最想对自己说的就是：“还好，当初坚持等待实验结果的验证，没有为了毕业，直接抛弃实验，将就地把结果投了文章”。所以，我最大的收获，也最想分享的便是——坚持!在顺利时，要坚持，不能懈怠!在不顺时，更要坚持，因为真相和曙光也许就在不远处了!
最后，要特别感谢我的导师刘欣老师和王前飞老师，感谢你们对我的耐心和帮助!希望未来我能做得更好，不辜负你们的期望!
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