二步发酵法生产维生素C：为国争光 造福人民｜朝花夕拾
2018/11/22 10:29:49 中国科学院微生物研究所
1983年1月，“用二步发酵法生产微生素C中间体—2—酮基—L—古龙酸的方法”获得国家科技发明二等奖
由中国科学院微生物研究所和北京制药厂研发成功的世界先进的维生素C二步发酵法向罗氏公司转让并在国内推广，形成了我国在此产业中的世界性相对优势，并获得国家发明奖二等。这个发酵过程在文献上虽曾有所探索，但成功大规模生产是中国人，其优点在于大大减少化工原料污染，改善工人劳动条件，缩短流程，并使生产成本明显降低，由于该工艺具有巨大的经济效益和社会效益，从而使我国一跃成为世界生产维生素C的大国，在国际市场上我国占85%的份额。这一成果是理论与实践相结合的范例，科技为第一生产力的体现，也是科技工作者勇于创新的丰硕成果。这项技术受到中国科学院各级领导的重视，微生物所和有关人员一再得到院里的表扬。目前该成果及相关资料在中国化工博物馆当代化工厅对外展出。
作为该项工作的主要参与者，在建所五十周年之际将这一研究过程和人员简略回忆，为我国科技发展留下一段历史的记录，对于继来者不无补益，但由于本人亲历的仅北京制药厂的这一段时间，必然不够全面，请读者鉴谅。
一、课题的出现
上世纪六十年代中期，因为文化大革命，研究工作实际已经停止或取消，科研人员经常下厂或下乡参加劳动。北京制药厂(简称北京药厂或厂)当时采用的维生素C(简称VC)生产工艺是所谓一步发酵法，即由葡萄糖用化工法加氢成为原料的山梨醇，经黑醋菌发酵成为山梨糖，山梨糖再经化学法使之转化成VC。该厂在山梨醇发酵成山梨糖的过程中经常感染噬菌体，影响产量，为解决这一问题，当时四室(生物物理室)的薛禹谷和庄增辉培育抗噬菌体生产菌株，因而该室和北京药厂经常有工作联系。当他们从北京药厂科技人员处了解到老工艺流程中污染严重、工人操作极端困难等问题，引起了该室科研人员的重视，由徐浩查阅相关文献和资料，得到了一定信息后，显然可以探索生物氧化来代替化学氧化，也就是改为用微生物转化山梨糖成VC前体2-酮基-L-古龙酸(简称2-KGA)(英文原文为2-keto-L-Gulonicacid，曾用名古洛酸、古罗酸)。经室负责人和科研人员讨论，决定参加的人员全部下厂，一方面响应号召接受工农兵再教育，一方面开展科研。经与北京制药厂商量，厂方欣然同意于1969年2月6日正式成立协作组，正组长为厂方人员，副组长为所方陶增鑫，厂方提供设备、原料及人员，所内不设置研究组。这个课题定名为“二步发酵”，是相对老工艺而言，生产VC经两步发酵，也可以说研究VC生产流程中的第二步发酵，但当时并没有具体计划、完成年限等。该室徐婉学、尹光琳和徐浩先下厂，以后徐婉学和徐浩先后调回，改为陶增鑫去。1969年-1970年，所里的研究室改变为连队，该课题就理所当然的归搞工业发酵的四连。1970年8月尹光琳要求回所，指派刚由“五七干校”回来的我去接替尹光琳，过了国庆，我又一次打起背包去接受工人阶级再教育，也就一个多月，陶增鑫和于龙华被叫回所，凡离开厂后，也就不是该课题的成员了，所以从那时起，该课题所方就我一人，直到双方认为任务基本完成，于1972年1月回所。然后安排我到再度改编为研究室的六室(酶室)工作，这时本所承担的二步发酵研究暂告一段落。
1974年7月，业务处郭新规通知我参加了中华人民共和国燃料化学工业部(简称燃化部)主持的VC二步发酵鉴定会，这次会议的鉴定书上明确肯定了“北京制药厂和微生物所首先找到了二步发酵新工艺的菌种N1197A，并初步确定了工艺路线”。1974-1978年尹光琳、淡家麟、曹桂芳、梁改芹、王大耜和洪俊华等在所内又继续了二步发酵的研制，并协助上海第二制药厂解决生产性试验不稳定问题，还对当时各厂所用菌种进行了系统的鉴定。1979年所业务处领导毛桂震组织了我和尹光琳、陶增鑫起草了申请书及5个附件，申请国家发明奖。1983年国家科委正式核准授予国家二等发明奖。1980年，在“微生物学报”发表了2篇有关2-KGA发酵的论文，一篇作者为严自正、陶增鑫等，另一篇为尹光琳、陶增鑫等。1985-1986年由东方科学仪器进出口公司和中国医药对外经济技术合作总公司出面将VC二步发酵新技术以当时巨款550万美元转让给国际著名的瑞士霍夫曼、罗氏有限公司。该技术的成功转让，标志着微生物所的科研工作迈上了一个新的台阶，科研人员为祖国人民做了一件有意义的事。
二、科研工作的艰辛历程
北京药厂位于朝阳门外，从中关村到厂乘公交车路上得2小时。那时哪有什么额外补贴，也不能买月票，而是每星期回家一次将公交车车票回所报销。当时口号是知识分子和工人同吃同住同劳动，在食堂吃饭，和厂里单身汉一样住集体宿舍，和厂里工作人员一起轮班，从打扫卫生、刷瓶子到看发酵罐(简称罐)，样样都干。有一次，轮到我一人上夜班，正巧1750立升罐用碱通蒸汽煮，声音响得异常，在夜间令人惊骇，至今那声音记忆犹新。正常情况下，上班动手操作，下班后整理记录，分析结果，再定下步计划。用发酵罐做流加试验时，要等测定结果出来后，才能定下一次流加时间和流加量，这样往往要连续工作十几个小时，而最紧张时，一连上9个夜班。不论摇瓶条件或发酵罐试验，大家共记一份记录，为了维护科研的科学性和所的权益，所以我向厂里提出要记录，车间主任说：“你来接受工人阶级再教育，要记录干什么。”无奈之下，只能在上夜班时，抽空挑重要的照原记录抄了350多页，这些资料至今还保留着，以后在申请国家发明奖写材料和在“微生物学报”上发表论文都是将此为依据的。
在这种艰苦条件下萦绕在科研人员脑海中依然是如何完成科研任务，尤其是课题刚开始，没有详细资料，没有菌种，又无设备，又无条件，样样从零开始，边干边创造条件。在前7个月一无所获，正当大家快要泄气时，出现一线希望，找到一个产2-KGA菌种，从该菌发酵液中得到了2-KGA结晶，从而增加了大家的信心。在1970年6-7月间，筛选到了产酸量稍高的菌株N1197A，但是能否提高该菌产酸能力，这时摆在科研人员面前的又一难题，如何下手，经苦苦思索，决定改变外界条件，使内因起变化。于是先用摇瓶做条件试验，不管工作量多大，都是交叉进行，一旦有好的结果，立刻将这结果用到罐上，然后在罐上反复试验，使2-KGA大幅度提高，而通过罐上流加试验，终于达到了目标，使底物山梨糖接近100%转化为2-KGA。就这样在厂方设备和大量人力支持下，两单位工作人员相互配合、共同努力下，在短短三年时间内，通过了上千个样品的分离，筛选了几千个菌株，摇瓶条件试验将近60批，发酵罐(1750立升、300立升和175立升)和种子罐试验将近100批，在厂里保存原始记录，叠起来有几尺高。最终确定了具有先进生产水平的第二步发酵工艺路线，并证实该发酵不同于传统，而是自然组合的混种发酵。为此，科研人员感到很欣慰，在所里无暇顾及情况下又在目前想象不到的艰苦条件下，兢兢业业，尽其所能，向祖国人民交了一份比较满意的答卷。
三、积极推广成果
在1971年5月北京市革委会计划组第九期的一个简报，报道了北京制药厂和微生物研究所研究成功维生素C二步发酵新工艺的消息，引起社会各界的关注。尤其于1971年9月在山西省太原市举行的“全国维生素丙学大庆经验交流会(简称太原会议)”，那次会议被认为在二步发酵法发展过程中，具有里程碑的意义，参加单位和人数都超过以往的维生素C的同行会议，在会上北京制药厂将二步发酵工艺作了全面系统的介绍，而我带去了由N1197A分离纯化后得到的大小菌株，无偿提供给与会者。其中上海第二制药厂和上海医药工业研究院有4-5人，除拿了大量菌种外，在休会时再三问我对二步发酵法的看法。我说根据我的判断，这条路线肯定可行，是大有希望的。会后，他们要参观北京药厂，回到北京，我家都顾不上回，领他们参观，并把做的情况，向他们又作了毫无保留的介绍，他们回上海后，即开展了大规模的二步发酵工艺的研制。在1974年燃化部组织的鉴定会，他们对我说：“我们吃了个现成饭”，以后该项技术转让给罗氏公司时，即在该厂进行的验收。
早在1970年10月，我和陶增鑫在摇瓶上不同发酵时间取样镜检时，观察到两种大小差别很大的菌体。1971年2月开始对N1197A分离纯化，经无数次试验后，证实N1197A中有大小两种菌落及菌体，大菌落(以后称大菌)生长旺盛，菌体大，不产酸；小菌落(以后称小菌)略带透明，生长微弱，菌体小，微产酸。只有当两者混合培养时才能和N1197A产酸相同，纯化后的大菌不再出现小菌落，同样小菌纯化后不再出现大菌落。从发酵罐中取出样品在平板上划线培养后均得到两种菌落，此结果出现令人振奋，这不同于传统的纯种发酵，是新的。当时并无什么成果菌种归属问题，只想早日把这工艺推广，更多的工厂参与，使之在全国开花结果，所以将分纯后的大小菌约有几十支带到上述的“太原会议”上，分发给各厂，并介绍了大小菌相互关系。这次会议后，很多工厂既了解了方法和流程，又拿到菌种，在各地很快开展了二步发酵研制，更有一些工厂用小菌搭配较N1197A中的大菌大得多的假单胞菌或芽孢杆菌混合培养，那时我所科研人员共收集到8个搭配菌株，小菌随之改变了编号，经王大耜、淡家麟和洪俊华等全面系统鉴定，8个搭配菌种中的小菌形态和生理生化特性完全相同，和N1197A中小菌也相同，说明搭配菌株中小菌来自N1197A，经鉴定均属氧化葡萄糖酸杆菌，而N1197A中的大菌系条纹假单胞杆菌。
几十年来一些研究单位相继进行了大小菌相互关系、固定化细胞、细胞融合、工程菌等研究，尤其很多工厂在投产过程中，不断改进和发展，随着生产厂家的增加，产量不断上升。目前我国用二步发酵法生产VC的厂有华北制药厂、石家庄制药厂、东北制药总厂和江山制药厂等，年产量将近11万吨，其中9万吨出口(维生素行业协会统计数据，由张启先提供)。从一个生产VC占世界份额很少的国家到大量出口，首先归功于改革开放的政策，其次是生产和科研单位的工作人员共同努力的结果，同时也给人们启示，研究微生物大有作为，前景广阔。可以造福人民，为国争光。
本文承陶增鑫、洪俊华、程光胜提出宝贵意见。
(作者：严自正)
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