干细胞居然是你身体里的抗癌能手（下）： 三个实验验证“永生DNA链假说”
2022/8/15 7:00:00 科学大院

    

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     之前我们介绍了“永生DNA链假说”，这是一个非常“聪明”的减少癌症发生率的方法，可以说保护着我们中的大多数人免得癌症。

     在科学探索的历程中，哪些实验验证了这个假说？

     非随机才是常态

     为了证明干细胞能够保留永生的DNA链，Cairns与Christopher Potten (1940-2012)合作，用³H胸腺嘧啶标记小鼠小肠干细胞形成时的DNA，4周后观察这些具有放射性的DNA分布情况。结果发现，随着细胞分裂次数的增加，具有放射性的DNA由于随机分配而不断“稀释”，导致放射性强度降低。

     但是在隐窝(crepts，小肠绒毛之间的凹陷处)深处，从底部往上算起第4位上的细胞放射性强度很高，与DNA刚被标记时相当。这里正好是小肠干细胞所在的位置，所以很可能是小肠干细胞在一直保留被标记的DNA链。用同样的方法， Cairns与Potten 在舌头味蕾基部(也是干细胞所在的位置)发现了少数保留放射性DNA的细胞。这些结果也都支持了永生DNA链的假说。

    

     小肠隐窝纵切片示意图，从下往上数第四个细胞即为小肠干细胞

     图片来源：参考文献14

     其他科学家对动物、植物、真菌进行了多次观测，并证实了Cairns的观察结果。在这些研究中，细胞都能长时间保留标记的DNA链，因而被称之为“标记保留细胞”(Label retaining cells, LRCs)。它们在数量上远少于组织中的其他细胞，而这正是干细胞在各种组织中数量的特点，其位置也符合用其它方法发现的干细胞的位置，与Cairns关于干细胞能够选择性地保留永生的DNA链的理论相符。这些实验说明DNA链的非随机分配是一个在生物界中普遍存在的现象。

     但是这些结果还不能证明这些细胞就是干细胞。如果在被标记之后有少数细胞出于某种原因不再分裂，这些细胞也能够长期保留被标记的DNA链。而干细胞的任务是替补老化和受损的体细胞，是必须进行分裂的，如果能够证明这些保留标记DNA链的细胞也在不断分裂，那就可以为这些细胞是干细胞的结论提供更有说服力的证据。

     双标记法证明标记保留细胞确实在分裂

     2002年，为了证明小肠绒毛中标记保留细胞确实在分裂，除了用³H胸腺嘧啶标记DNA链外，Potten还用BrdU(溴代脱氧尿苷)标记以含³H的DNA链(爷爷辈的)为模板合成的DNA链(父亲辈的)。在BrdU标记后的第一天，90%以上的小肠绒毛隐窝第4位的细胞都被³H和BrdU同时标记，说明这些细胞在被³H标记后进行过细胞分裂(这样BrdU才能组入新合成的DNA链)。

     在往后的日子中，第4位的细胞一直保留³H标记，而BrdU的信号却逐渐下降，到第8天时信号强度只余下3%。如果第4位的细胞不分裂，³H和BrdU的信号都应该一道被保留，而如果细胞分裂时DNA的分配是随机的，³H的信号和BrdU的信号都应该同时被稀释而不断降低。实际观察结果说明，这些细胞在不断地进行不对称分裂。继续作为干细胞的子细胞保留了被³H标记的、辈分较高的DNA链，而被BrdU标记的父亲辈DNA链则被分配到要进行分化的子细胞中去，在其后的对称分裂中逐渐被稀释。这是对小肠干细胞进行不对称分裂，选择性地保留DNA链原件最强有力的证据。

     此后，科学家们进行了更多次双标记法标记细胞的实验，均表明动物组织中那少数保留DNA链原件的细胞确实在不断地进行分裂，进一步支持了这些细胞是干细胞的想法。

    

     用BrdU标记的人体心脏细胞DNA链所观测到的DNA随机分离(A)与非随机分离(B)现象

     图片来源：参考文献15

     不过这些实验还没有完全证明保留DNA链原件的细胞真的具有干细胞的特征，而继承辈分低的DNA链的细胞真的是要进行分化的细胞。随着干细胞研究的进展，这个问题也被解决了。

     保留DNA链原件的细胞具有干细胞的特征

     2007年，美国斯坦福大学的Thomas Rando用氯代脱氧尿苷(CIdU)和碘代脱氧尿苷(IdU)来标记小鼠的肌肉干细胞。干细胞原本的DNA是爷爷辈的，不进行标记；其第一轮分裂时形成的DNA为父亲辈的，用CIdU标记；第二轮分裂时的DNA为儿子辈的，用IdU标记。标记后的细胞被分开为单个细胞培养，让细胞完成第二轮分裂。

     为了更好地追踪细胞第二轮分裂的情形，Rando在培养基中加入了细胞松弛素(cytochalasin D)。细胞松弛素不影响细胞核的分裂，但能使分裂形成的两个子细胞不会完全分开，而是形成细胞对，这样就可以确保这两个细胞是来自同一个干细胞。染色结果表明，所有的子细胞都含有IdU的染色，但是CIdU染色只集中在其中的一个子细胞中。由于CIdU标记的是父亲辈的DNA链，不显示CIdU染色的细胞应该就是爷爷辈的DNA链。那么是哪一个子细胞仍然保留干细胞的特性，哪一个子细胞会进行细胞分化呢？

     在这里，Rando利用“肌间线蛋白”(Desmin)来区分两个子细胞。由于要分化为肌肉细胞的那个子细胞会表达肌间线蛋白，而继续保留为干细胞的那个子细胞不会表达肌间线蛋白，看看肌间线蛋白在哪个子细胞中表达，就可以知道哪一个是干细胞，哪一个是要分化的细胞了。

     实验结果表明，继承CIdU标记的子细胞表达肌间线蛋白，而不继承CIdU的“子”细胞不表达Desmin，这就清楚地表明继承爷爷辈DNA链的子细胞继续为干细胞，而继承父亲辈DNA链的子细胞是要进行分化的细胞。

     与这一实验差不多同时期，其他科学家又进行了多次类似实验，结果均表明动物组织中的确存在少数不断进行分裂，而又能保留DNA链原件的细胞，而且这些细胞还表达干细胞的标记物，或者不表达要分化细胞的标记物(如上述实验中的肌间线蛋白)，证明这些细胞确实是干细胞。Cairns在1975年提出的干细胞保留永生DNA链的理论，也得到了充分的证明。

    

     毛囊干细胞DNA随机分离(左)和非随机分离(右)，其中DAPI、CyA、Lgr5等均为蛋白质类型，它们都是证明细胞处于不断分裂中的标记物

     图片来源：参考文献16

     干细胞是如何保留DNA原件的？

     在真核细胞中，DNA被复制时误差率极低，每个碱基对改变的几率大约只有亿分之一，因此新合成的DNA链在序列上与原件的相同程度超过99.999999%。例如小鼠有两份DNA，每份DNA有大约25亿碱基对，每次细胞分裂造成的序列变化不过几十个碱基对。小鼠的每份DNA被分为20条，每条序列的改变就平均只有几个碱基对，小鼠的干细胞是很难从这么小的差别来判断DNA的辈分的。此外，在新合成的DNA链中，序列改变的位置和情形还是随机的，细胞根本无法预测序列的改变位置和情形，也就无法根据这少量序列的差别来识别DNA原件。

     不过，细胞可以通过表观遗传修饰来分辨其中DNA的辈分。真核细胞中的DNA并不是仅有碱基对，而是和组蛋白(histones)结合，组成“染色质”(chromatid)。组蛋白聚合成许多小球，DNA缠绕于其上。细胞分裂时，染色质高度浓缩，才成为在显微镜下容易看到的“染色体”(chromosome)。所以我们在前面谈到的细胞分裂时DNA的分配，其实是分裂期染色体的分配，分配的不仅是DNA，还有与之结合的组蛋白及其修饰状态。

    

     DNA的结构，图中小球即为组蛋白，缠绕在组蛋白上的线状物为碱基对，二者平时如同图片右下角一样，为“散装”毛团状，只是到了细胞分裂时才会聚合在一起形成我们印象中的短棒状“X”形染色体

     图片来源：wikipedia

     组蛋白的修饰方式有多种，包括乙酰化、甲基化和磷酸化。简而言之，就是在组蛋白的氨基酸侧链上加上不同的基团，比如乙酰化是加上乙酰基(CH3CHO-)、甲基化是加上甲基(-CH3)、磷酸化是加上磷酸根等等。不同的基团，其功效不同，让DNA启动、停止，或是合成不同的蛋白质——也就是说，这些修饰不改变DNA的序列，却影响基因的表达状况，这就是“表观遗传修饰” (epigenetic modifications)。

     不同辈分的DNA表观遗传修饰的状况不同，就可以成为细胞识别辈分的机制。这有些像人身上穿的衣服。模板DNA和新合成的DNA就像双胞胎兄弟，彼此极为相似。如果它们再穿同样的衣服(组蛋白)，他们之间的差别就极小，几乎无法辨别。但是如果在双胞胎兄弟穿的衣服上做出改变，例如配戴上不同的徽章，就容易区分他们了。组蛋白的修饰就相当于是在衣服上佩戴各种徽章，细胞也就可以识别它们了。

     要选择性地分配DNA(染色体)，除了要区分染色体的差别，还要区分纺锤体中的两个中心粒。这样辈分高的DNA才“知道”与哪个中心粒相连，从而进入特定的子细胞。实际的情形也的确如此：细胞分裂时，每个子细胞只接收1个中心粒，在下一次细胞分裂前，这个中心粒进行复制，形成两个中心粒，所以两个中心粒的辈分不同，它们所结合蛋白质(例如Ninein和Cenexin)的情形也不同，这样不同的中心粒就可以和不同辈分的染色体相互识别，并分别进入命运不同的子细胞中。

     Cairns当初提出永生DNA链的理论时，考虑的主要是DNA序列改变与癌症发生率之间的关系，但是随后的科学研究结果表明，干细胞选择性保留的，并不只是DNA序列的“原始文件”，还包括与高辈分DNA链相联系的组蛋白的表观遗传修饰。它们共同决定了子细胞是继续保持为干细胞还是分化为体细胞。

     结语

     我们的身体每天要进行大约2万亿次细胞分裂。尽管有这么多次的细胞分裂，但是多数人在一生中并不会得癌症，其中一个重要的原因就是干细胞有保留DNA原件的本事。

     当然这个机制也不能保证我们完全不得癌症。干细胞除了进行不对称分裂，有时也会进行对称分裂，即两个子细胞都是干细胞，以便在需要时增加干细胞的数量，或者在干细胞受损的情况下恢复干细胞的数量。在对称分裂过程中，低辈份的、带有序列变化的DNA链就会被保留在一部分干细胞中，因此不是所有的干细胞都能够永远保留DNA的原件。

     而且除了细胞分裂导致的DNA序列变化，身体内部(例如活性氧)和外部(例如紫外线和环境污染)的因素也能够破坏DNA，造成干细胞DNA的序列变化，这是一部分人仍然会得癌症的原因。

     但是干细胞保留DNA原件的机制，仍然在保护着我们中的大多数人免得癌症，我们也应该感谢生物演化过程创造出来的这个奇迹。

     参考文献：

     [1] Cairns J，Mutation selection and the natural history of cancer. Nature 1975；255:197–200.

     [2] Rando TA, The Immortal Strand Hypothesis: Segregation and Reconstruction. Cell 2007；129:1239-1243.

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     [5] Potten CS, Hume WJ, Reid P，Cairns, J, The segregation of DNA in epithelial stem cells. Cell 1978；15:899-906.

     [6] Merok JR, Lansita JA, Tunstead JR, Sherley JL, Cosegregation of chromosomes containing immortal DNA strands in cells that cycle with asymmetric stem cell kinetics. Cancer Research 2002；62:6791–6795.

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