CAR-T治疗实体瘤迎来重大突破，发现了对抗侵袭性实体瘤的最佳T细胞!
2018/1/12 23:50:11 91Miracle
今年对于癌症免疫治疗领域来说，无疑是非常重要的一年。多个CAR-T疗法的相继获批上市，为许多之前无药可治的晚期血液肿瘤患者，带来了治疗甚至治愈的希望。然而，相比于在血液肿瘤治疗邻域研究过程中的顺风顺水，CAR-T在实体瘤治疗邻域的研究可谓是举步维艰，收效甚微。
问题在于体内的数百种类型的T细胞，并不是每个都能成为好的癌症战士。而鉴别和筛选出对抗高度恶性肿瘤所需的确切T细胞是非常困难的，这类T细胞必须浸润肿瘤，并且能够在恶劣的癌症环境中存活足够长的时间以杀死所有的肿瘤。
幸运的是，来自美国南卡罗莱纳医科大学(MUSC)，Hollings癌症中心的一个研究团队找到了这种具备以上要求的，能够对抗侵袭性实体瘤的T细胞，研究由微生物学和免疫学副教授Chrystal Paulos博士领导，并将这一突破性发现发表在顶级学术期刊《Nature Communications》上。表明表面具有CD26蛋白的T细胞具有最佳的抗癌能力。
CD26高水平人T细胞被激活并显示出抗肿瘤活性(图片来源 nature)
这个发现之路始于团队开始研究一系列过继性细胞治疗(ACT)中尚未广泛使用的T细胞(有许多不同的T细胞家族)，大多数过继性细胞治疗(ACT)使用的是CD8家族的T细胞，但Paulos团队选择专注于CD4家族。
Paulos团队的研究生Stefanie Bailey和论文的主要作者解释道：“在免疫治疗中，CD4 T细胞通常情况下是被忽视的。由于CD8 T细胞具有很强的抗癌能力，因此在这方面的研究存在偏差。而CD4 T细胞主要以帮助其他细胞发挥功能而闻名，被称为”辅助性T细胞”。但该研究表明，CD4 T细胞也能清除癌细胞”。
CD8+T细胞、Th1细胞抗肿瘤活性逐步衰退， Th17细胞抗肿瘤活性持续存在 (图片来源MUSC)
在此之前，该研究小组发现了一种称为Th17细胞的特殊类型的CD4 T细胞，对侵袭性实体瘤非常有效。但他们需要方法来鉴定血液样本中的Th17细胞，将其筛选出来并用于过继性细胞治疗(ACT)。在此之后，一项新的研究引起了Bailey的注意，他们发现表面上带有CD26蛋白的T细胞携带Th17标记物。而CD26是位于细胞表面的一种多功能蛋白，并且在免疫学领域是非常有名的。
CD26/Th17(图片来源 nature)
虽然CD26是众所周知的，但Paulos的研究小组是第一个研究它在抗癌方面的作用。首先，他们发现所有的CD4 T细胞表面上的CD26蛋白表达水平都不相同，有的CD26很少甚至没有，有的是中等水平，有的高水平。此外，这三种CD26表达水平的T细胞组对抗癌症的能力也大不相同。
CD26阴性T细胞迁移能力增强，但持续性低，无法应对肿瘤复发问题。CD26 中等程度表达和CD26高表达的T细胞表现出相似的抗肿瘤活性，但免疫学特性显着不同。尽管迁移能力不高，但CD26 中等程度表达的T细胞能够持续存在。CD26高表达的T细胞表现出抗凋亡和干细胞特性，且能够长期持续存在，共分泌多种细胞因子和细胞毒性分子，具有天然的向各种实体瘤迁移的能力(图片来源 nature)
基于初步试验显示出的高CD26 T细胞具有许多弱免疫细胞的特征，研究小组猜想，高CD26水平的T细胞对抗癌症的能力比较差，但结果却令人惊讶，更深入的研究表明恰恰相反。
Bailey说：“当你看到高CD26 T细胞时，它们看起来很“疲惫”，似乎无法对癌症产生长期的反应，因为它们的表现并不像我们希望用于治疗的那种T细胞。但结果却可以用“非常震惊“来形容”，这些高CD26的T细胞不仅可以杀死多个实体肿瘤，而且还可以在病人身上长期存活下来。”
不管外在表现如何，但高表达CD26的T细胞具有其他两种类型的细胞缺乏的两个关键特征。首先，它们能抵抗细胞凋亡(导致细胞死亡的过程)并在恶劣的肿瘤环境中存活。其次，它们具有干细胞样的特性，在注入患者体内后能够重新并持续生长。
CD26高水平的T细胞具有干细胞特性和强迁移能力(图片来源 nature)
而过继性细胞治疗(ACT)的过人之处就在于它是一种活细胞疗法。也就是说，T细胞杀死肿瘤后，会继续存在于患者体内，所以如果肿瘤复发，那么T细胞可以再次对它们发起攻击并将其杀死。
研究小组发现，CD26高水平的T细胞是优秀的癌症战士，将有助于推动T细胞免疫治疗在癌症和其他自身免疫性疾病中的应用。到目前为止，研究人员寻找了多个标记来鉴定过继性细胞治疗(ACT)的最佳T细胞。这一突破性发现表明，一长串的备选标记可以缩短为一个：CD26。现在，研究人员可以通过CD26的表达水平来鉴定具有优越治疗潜力的T细胞，从而可以最大限度地增加过继性细胞治疗(ACT)成功杀死肿瘤的机会。
此外，该研究小组还观察到，在实体瘤中，具有CD26的T细胞在肿瘤部位能够产生更好的治疗反应，表明在肿瘤浸润性T细胞上具有CD26表达直接与患者的反应相关。
MesoCAR-T细胞疗法：间皮瘤小鼠模型(图片来源 nature)
MesoCAR-T细胞疗法：胰腺癌小鼠模型(图片来源 nature)
动物研究模型包括黑色素瘤、间皮瘤和胰腺癌。当增加CD26供体T细胞百分比浸润肿瘤时，携带这些类型肿瘤的动物模型获得了更好的治疗结果。其中黑色素瘤治愈率为50%，间皮瘤为95%。对于胰腺癌没有治愈性的反应，但肿瘤缩小了67%，并在临床前模型中延长了小鼠存活期。这些研究结果表明，该疗法或许在联合治疗方面效果很好。
Paulos补充说：“我们对这一发现的更广泛的临床意义感到兴奋。使用高表达CD26的 T细胞不仅有益于过继性细胞治疗(ACT)，而且还有助于增强其他癌症免疫疗法(如检查点抑制剂、疫苗和细胞因子疗法)的有效性，不同表达水平的CD26 CD4 T细胞也可以用来治疗感染性疾病和自身免疫病的患者。
无独有偶，在同期《Nature Communications》的一篇报道也是关于不同T细胞在实体瘤的表达。
美国加利福利亚大学圣地亚哥分校的Ananda W. Goldrath教授与来自斯克里普斯的Matthew E. Pipkin教授合作，发现了驱动T细胞离开淋巴组织聚集在外周以及肿瘤组织中的关键—Runx3蛋白。这种蛋白质会对T细胞的基因进行重编程，促使T细胞内与组织驻留相关基因的大量表达。同时研究人员还在小鼠体内证明，增加这一基因的表达，可以显著增强过继性T细胞在实体瘤中的聚集增强治疗效果。这一发现发表在全球顶级期刊《自然》杂志上。
Goldrath教授(黑色衣服)
大家都知道，在面对感染或是肿瘤生长时，我们机体的T细胞会在脾脏以及淋巴结内迅速繁殖，并获得杀死病原体以及癌细胞的能力。同时要消灭组织中的癌细胞和病原体，杀伤性T细胞还要迁移并定植到相应组织发挥作用。然而，人们一直以来都没有弄清楚，长期游走于淋巴血液循环中的杀伤性T细胞如何“学会”离开自己的家园定殖在肺部、肠道、皮肤、或实体瘤组织内的。
不过虽然寻找驱使T细胞离开淋巴系统定殖到感染部位以及实体瘤组织的因子一直被认为是一项艰巨的挑战。但找到这一因子无疑对于癌症的免疫治疗至关重要。毕竟，不能在肿瘤组织中定殖的T细胞就是一堆咸鱼，免疫治疗都扶不起来。
正在和癌细胞对抗的T细胞
那么，Goldrath教授是如何找到这一关键因子的呢？
此前的研究已经表明，作为机体免疫防御重要部分的记忆性T细胞，主要分为三类，一类称为循环记忆T细胞主要存在于淋巴血液循环，另一类称为组织常驻记忆T细胞，主要驻扎在机体外周各个组织内，最后一类在二者之间来回转换称为效应记忆T细胞。同时，人们还发现，循环记忆T细胞与定殖在组织中的组织常驻记忆T细胞的基因表达有着显著的差别。
显然，驱动组织常驻记忆T细胞一系列基因变化最上游的信号，就是研究人员要找的驱动因子。
为了寻找这一因子，研究人员可谓是煞费苦心。首先，他们采用了之前已经确定的研究组织常驻记忆T细胞的小鼠模型(5)。通过对小鼠脾脏内的杀伤性T细胞用P14基因标记，然后利用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染小鼠肠道，并对P14T细胞进行跟踪。结果不出所料，病毒感染后，这些P14T细胞主要分为两类，一类会游走于淋巴血液循环之间，而另一类会进入小肠粘膜抗击病毒，并分化出组织常驻记忆性T细胞留在小肠粘膜内。
随后通过对小肠粘膜内的P14记忆T细胞和淋巴血液循环中的P14记忆T细胞进行转录组分析发现，它们的基因表达都有显著的差别，表现为，相比于淋巴血液循环中的记忆性T细胞，在组织常驻记忆性T细胞内与组织定殖相关的基因大量表达，例如CD103，CD69。不仅如此，通过对二者的前体细胞进行染色体开放性测序分析发现，二者的前体T细胞也是完全不同的。
同时，研究人员还联合了由染色体开放性测序分析，转录组分析，PageRank算法的电脑筛选以及体内基于小分子干扰RNA的功能丧失筛选两种方法，来确定组织常驻记忆T细胞中介导组织定殖相关基因表达的上游信号。
通过电脑筛选，研究人员确定了一些目前已知的调节组织常驻记忆T细胞分化的转录因子，例如Blimpl，Nr4a1,Eomes，T-bet等等，以及许多之前并不知道在对于组织常驻记忆T细胞分化有什么影响的转录因子，例如Nr4a3以及Runx3。而联合功能筛选后，研究人员最终确定了Runx3是决定组织常驻记忆T细胞命运的关键因子。表现为，在小鼠体内，当研究人员使用RNAi抑制组织常驻记忆T细胞Runx3基因的表达可以使定植在小肠粘膜内的T细胞离开组织，回到血液循环。
不仅如此，研究人员之后还对小鼠所有外周组织中的记忆性T细胞(包括皮肤，粘膜，肾脏，肺等)进行转录组分析，发现，相比于淋巴血液循环组织中T细胞Runx3的低表达，定殖在这些组织内的记忆性T细胞Runx3表达显著提高，同时其与组织驻留相关的基因表达也显著增加。同时，研究人员还确定了Runx3的一部分基因调控网络。
Pipkin教授(最右)
除此之外，此前的研究还表明，肿瘤组织浸润杀伤性T细胞与组织驻留记忆T细胞的基因表达有很强的相似性。为此研究人员特地从小鼠黑色素瘤组织以及人体乳腺癌组织中提取了杀伤性T细胞进行转录组分析，发现肿瘤浸润T淋巴细胞的组织驻留相关基因表达也全都是由Runx3驱动的。
最后，在黑色素瘤小鼠模型内，研究人员还证明了，使用过继性T细胞治疗时，抑制Runx3基因的表达可以显著抑制T细胞在肿瘤组织的聚集，肿瘤生长速度显著加快，而促进Runx3基因的表达，则可以显著促进T细胞在肿瘤组织聚集，抑制肿瘤生长。同时，这一过程并没有影响T细胞向肿瘤组织迁移。这进一步证明Runx3是通过促进T细胞定植，而不是召唤更多的T细胞来发挥作用的。
抑制Runx3基因表达，显著抑制T细胞在肿瘤组织聚集(左)，促进Runx3表达则显著增加T细胞在肿瘤组织聚集(右)TIL代表肿瘤浸润T细胞
这一发现，对于免疫治疗领域来说无疑是非常重要的。由于CAR-T提取的主要是患者淋巴血液循环中的T细胞，Runx3低表达无法在肿瘤组织聚集，这一发现显然可以解释为什么CAR-T对实体瘤效果不好，同时这无疑也意味着Runx3将成为CAR-T治疗实体瘤的一个好搭档。正如本文通讯Pipkin教授表示，“未来我们或将使用Runx3重新编程将要进行过继性转移的T细胞，以帮助它们聚集在实体瘤内。”
此外，其不仅仅是增强免疫疗法的有效性，它还能提供更多潜在益处。比如说：如果患者获得了正确的细胞类型，也许治疗过程中就不需要那么多的细胞，这样就可以减少很多费用以及治疗时间。这对于患者来说，绝对是意义重大。毕竟已经上市的两款CAR-T细胞产品价值不菲，而且对于接受细胞治疗的患者来说，时间无疑也是最为关键的一个环节，考虑到患者病情已经到达晚期，每拖延一天就会耽误治疗时间
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