AZD9291对EGFR外显子20插入的预期效果及体外实验报告
2018/6/1 4:43:36 91Miracle
EGFR外显子20插入(Ex20Ins)占非小细胞肺癌(NSCLC)中EGFR激活突变的4%~10%。Ex20Ins突变肿瘤一般对第一代靶向药特罗凯/易瑞沙和第二代阿法替尼无反应，而对于目前EGFR外显子20插入治疗以化疗为主。Osimertinib(AZD9291)是第三代egfr靶向药，批准治疗晚期NSCLC的EGFR T790M突变，然而Osimertinib(AZD9291)在EGFR外显子20插入非小细胞肺癌中活性并未得到充分的评估。
使用crispr-cas 9技术分离出常见的ex20ins突变，即ex20insD 770_N 771 InsSVD(22%)和Ex20 Ins V 769_D770 InsASV(17%)。我们对ex20ins突变细胞使用了Osimertinib(AZD9291)和AZ5104(Osimertinib代谢产物)发现能够在体外抑制ex20ins突变细胞的信号通路和细胞生长并表现出对肿瘤长期抑制效果。
EGFR外显子20插入(Ex20Ins)是非小细胞肺癌(NSCLC)中发现的第三种常见egfr激活突变，外显子19(Ex19del)和外显子21的L858R突变，这两个突变占所有EGFR突变的百分之九十。而EGFR Ex20ins占egfr突变的百分之四到百分之十。与EX19del和L858R不同，大多数EX20INS突变在临床前和临床研究中发现对目前批准的靶向药都存在耐药性，相关如特罗凯(厄洛替尼)，易瑞沙(吉非替尼)，阿法替尼(afatinib)除了罕见的A763_Y764INSFQEA突变(Ex20ins突变的6%)是报告对这些EGFR-TKIS敏感的唯一EX20INS突变。
晚期非小细胞肺癌长期生存期依然不乐观，5年整体生存率不到5%，但在近几年的发展中有致癌基因突变的非小细胞肺癌患者中位生存率得到了极大的改善，而对于EGFR Ex20 Ins治疗仍然是类似于治疗EGFR野生型肿瘤的常规化疗。然而肺腺癌很可能依赖EGFR Ex20Ins，就像他们依赖于其他转化的EGFR突变来生长和生存一样。因此寻找可以抑制EX20INS突变的靶向药十分关键。
Osimertinib(AZD9291)是一种新一代的EGFR tki，具有抗标准激活和t790M突变型EGFR的效果，已获得上市批准(包括在美国、欧洲和日本)T790M阳性晚期非小细胞肺癌的治疗。Osimertinib(AZD9291)在EGFR Ex20 Ins患者中的潜力仍有待全面评估。利用Ba/F3细胞系进行的体外实验表明Osimertinib对某些Ex20Ins突变有很强的抑制作用，但这项研究没有研究更多疾病相关模型的效果，也没有评估体内活性。进行进一步评估Osimertinib(AZD9291)对EX20INS突变效果。
Ex20InsD770_N771InsSVD (H2073-SVD)和Ex20Ins V769_D770In-sASV(H2073-ASV) 是Ex20Ins最常见的两种突变，约占Ex20Ins突变的40%(附图S1a和S1B)。当在1%血清条件下培养时，H2073-SVD和H2073-ASV细胞系独立于外源性EGF的添加而生长，而H2073-WT细胞系在缺乏EGF时不能增殖(图1A)。表皮生长因子和血清均能刺激细胞系增殖，但这些因素不能增加1%个血清条件下的外显子20插入突变体的增殖，表明在低血清背景下已经发生了最大程度增殖。显示外显子20插入的驱动生长表型与低血清中持续的EGFR通路激活相关，如图所示。
图1 EGFR EX20Is诱导EGF配体独立的增殖，并在细胞内形成内化。A增殖成倍增长(P<0.01)B、H2073-WT、H2073-SVD和H2073-ASV细胞在低(1%)血清中生长(或不添加EGF)或常规(10%)血清中的pEGFR和tEGFR水平。C、H2073-WT、H2073-SVD和H2073-ASV细胞的共聚焦切片染色为EGFR(红色)、EEA1(绿色)和DAPI(蓝色)。
见图1b先前所示，使用EGFR TKI或使用siRNA对抗EGFR(补充图S2A)显示H2073-WT细胞株依赖于EGFR。相似地敲除EGFR siRNA基因可抑制H2073-SVD和ASV细胞的存活(附图S2A)。因此，EGFR基因敲除这些细胞可强烈抑制通过RAS/MAPK通路的信号传递(补充图S2B)。诱导的Caspase激活与对照siRNA的关系(附图S2C)
为进一步了解Ex20Ins突变的生物学影响，并且因为对受体定位的影响还没有进行过报道，我们用共聚焦显微镜比较Ex20Ins突变体生物学与EGFR野生型(WT-EGFR)。如所料，EGFR野生型(WT-EGFR)主要位于H2073-WT细胞没有存在刺激配体。然而相比之下，在H2073-SVD和H2073-ASV细胞株中，表皮生长因子受体似乎都出现了内化和共定位。 EEA1早期内体的标记物(图1C)。改变的EGFR定位表明EGFR EX20s的内体信号可能是调节EGFR依赖性肿瘤发生的重要机制，因此可能与已报道典型激活EGFR突变体类似的方式发出信号。这些数据表明，H2073-SVD和-H2073-ASV细胞株可以独立于EGF生长，同时维持对 EGFR 信号通路的依赖性存活。 总的来说Ex20Ins突变体可能以类似于Ex19del和L858Rm的方式发出信号 尽管有结构上的差异。
EGFR外显子20外显子在体外对osimertinib敏感。接下来，我们评估了潜在临床相关EGFR TKIs抑制EGFR磷酸化和增殖体外EGFR EX20Is突变体的表达细胞。符合临床相关一代和第二代经批准的tki(吉非替尼、特罗凯和阿法替尼)显示出高水平的抗COS-7基因工程模型的Ex20Ins FQEA变异的磷酸化作用。(图2A)
其中重要的是Osimertinib和AZ5104的高效水平概括(图2A)。Osimertinib和AZ5104也能有效抑制其他EGFR EX20S变异体NPG、SVD和ASV的磷酸化，并且与可逆TKI厄洛替尼相比，在每种变异体中都表现出更大的效力(图2A)。
有趣的是，第二代不可逆TKI 阿法替尼同样显示出对所有EX20S变异体的高活性(图2A)Osimertinib对比阿法替尼 吉非替尼在t790m上表现出更高的活性程度，Osimertinib对比Ex20Ins与野生型EGFR中显示出对Ex20Ins更高的活性。因此我们探讨了如何把对EX20Is的活性转化为细胞增殖的抑制。
Osimertinib(图2B)和AZ 5104(图2c)补充图(图s3a) 对H2073-FQEA、H2073-SVD和H2073-ASV细胞具有类似的抑制作用。Osimertinib在Ex20Ins和野生型EGFR之间没有表现出相同的选择性，尽管这种选择的来源还不清楚(例如信号阈值的差异)。而吉非替尼和阿法替尼对临床敏感的H2073-FQEA也显示出极高的效力。(图2D和E)
A
Compounds
EGFR Ex20Ins NPG (COS7)
IC50
EGFR Ex20Ins SVD (COS7)
IC50
EGFR Ex20Ins ASV (COS7)
IC50
EGFR
Ex20Ins FQEA (COS7) IC50
EGFR WT (H2073) IC50
EGFR Ex20Ins SVD (H2073)
IC50
Erlotinib
98
(n = 3)
(36,264)
867.2
(n = 3)
(279.7,2688.6)
1450.5
(n = 4)
(635.7,3309.6
11.4
(n = 5)
(8.4,15.4)
25.8
(n = 6)
(14.2,46.8)
1273.6
(n = 4)
(20.3,79793.8)
Afatinib
2.7
(n = 15)
(1.9,4)
5.9
(n = 47)
(5.0,6.8)
4.9
(n = 10)
(3.7,6.5)
5.3
(n = 8)
(3.6,7.8)
4.9
(n = 18)
(3.0,8.0)
6.1
(n = 12)
(4.6,8.1)
Osimertinib
6.2
(n = 3)
(2.6,15.2)
59.6
(n = 3)
(19.0,186.7)
28.7
(n = 3)
(15.7,52.7)
13.9
(n = 6)
(7.3,26.5)
470.1
(n = 8)
(196.9,1122.2)
96.6
(n = 6)
(55.5,168.3)
AZ5104
1.9
(n = 5)
(1.4,2.5)
6.7
(n = 4)
(4.0,11.4)
4.4
(n = 4)
(3.7,5.3)
6.7
(n = 7)
(4.8,9.2)
20.8
(n = 9)
(14.8,29.2)
9.5
(n = 6)
(3.9,22.9)
图2.EGFR外显子20插入突变对EGFR TKIs的体外敏感性。在体外。数据表示为C 50(nmol/L)值，由至少两个单独的实验表示，95%符合区间值括号内。(B)Osimertinib(C)AZ 5104(D)ge?tinib(E)afatinib 在一定浓度下对H 2073、H2073-SVD和H 2073-ASV细胞的增殖影响。增殖后4天的治疗和绘制相对于未处理的对照组，所给出的数据的结果。平均值n<3 t SD(m，p<0.05)计算
图3.Osimertinib和AZ 5104单药在体内均能抑制NSCLC H2073 Ex20Ins SVD和ASV移植瘤的增值，每日给药的剂量，Osimertinib 25 mg/kg，每日一次，AZ5104 50 mg/kg，每日一次或阿法替尼7.5或20 mg/kg，皮下注射(A)H 2073-SVD(B)H 2073-ASV 小鼠肿瘤模型。C和D均未观察到肿瘤体积缩小(小于起始大小的10%)
与Osimertinib相比，早期一代的TKIs对H2073-SVD和H2073-ASV细胞株的活性明显低于egfr野生型(图2D和E 补充图S3C和S3D)。
这些数据表明，Osimertinib和它的代谢物AZ 5104能有效抑制EGFR中携带EX20S突变的细胞系的EGFR磷酸化和增殖，与目前批准的第一代和第二代相比，具有更有利的突变选择性
Osimertinib和AZ 5104在EGFR Ex20Ins体内肿瘤模型中对肿瘤生长的抑制作用大于阿法替尼。
为了探讨osimertinib及其代谢物az5104的体内活性，我们给两种不同的非小细胞肺癌EGFR crispr偏辑H 2073细胞株进行了单药治疗。分别是Ex20Ins SVD(D 770_N 771InsSVD)和Ex20InsASV(V769_D770InsASV)。与临床经验一致，Ex20Ins SVD和ASV赋予原发性耐药达到7.5mg/kg，代表阿法替尼40毫克临床起始剂量的剂量(图3A和B)。H 2073细胞系对类似剂量的阿法替尼敏感(补充图S4)，表明原发性耐药是由于EX20Is而不是细胞系背景所致。
与临床相关的afatinib活性差的情况不同，每天一次给药25 mg/kg的osimertinib(相当于临床批准的80 mg剂量)或最大耐受剂量的AZ5104对 Ex20Ins SVD (65%, P < 0.001 and 95%, P < 0.001, respectively at day 14) )和Ex20Ins ASV (82%, P < 0.001 and 95%, P < 0.001, respectively at day 14) 均有抑制作用。两种化合物均耐受性良好，观察到最小肿瘤体积缩小(小于起始肿瘤的10%)(图3C和D)。
osimertinib和AZ5104抑制EGFR磷酸化及下游信号转导通路
为探讨靶点基因表达的关系，对H2073-SVD肿瘤的小鼠进行了一次抗肿瘤治疗。
A.ELISA法测定 B.6小时时间点肿瘤的免疫印迹.C.pAKT法测定.D.pERK1/2法测定
单剂量Osimertinib 25 mg/kg，AZ 5104 50 mg/kg，afatinib 7.5或20 mg/kg
并分别于1、 6、16、24、30小时取出瘤体进行检测，分别综合EGFR途径生物标志物用来评估EGFR TKI在肿瘤组织中的影响。通过评估ELISA(图4A；补充图S5A)和Western blot(图4B)，以及通过免疫印迹法评估PHOPHOAkt和磷酸化ERK抑制药效学效应(图4C和D补充S5B和S5C)
然在小鼠中，Osimertinib和AZ5104的药代动力学半衰期仅为约3小时(13)，但在16小时时间点(图4A)下，磷酸化EGFR染色仍显著减少，符合其预期的不可逆作用模式。有趣的是，尽管下游信号标志物在6小时后同样表现出最大抑制，与PHOSPHO-EGFR相反，它们显示更短暂的抑制(图4C和D)。类似的观察是在阿法替尼使用之后出现。AZ5104与Osimertinib与阿法替尼相比，对EGFR和下游信号通路的抑制作用更强的疗效和短暂。使用H2073-ASV(补充图S6A-S6C)观察到类似的结果。这些数据表明,Osimertinib和AZ5104均能在体内实现抑制肿瘤生长相关的EX20Ins通路。
Osimertinib和AZ5104在EGFR EX20Is PDX模型中的作用
尽管在H2072和COS-7模型中观察到的体外和体内活性引人注目，但它们代表非内源性基因系统。因此，我们希望使用更直接相关的患者肿瘤(PDX)模型来评估效果。引人注目的是，在一个PDX模型(LG1423)中与H2073-研究使用相同的EGFR EX20Ins V769Y7D770sASV变体，每天剂量25 mg/kg Osimertinib诱导的肿瘤生长抑制率高于20毫克/公斤剂量的阿法替尼60%(P<0.001和18%)。与对照组相比，在第22天时(图5A)。同样单独的实验中，与对照组(图5b)相比，Osimertinib的肿瘤生长抑制优于厄洛替尼93%(P<0.001和15%)。尽管实验上存在变异性，但与早期的tki相比，Osimertinib在临床相关上始终表现出更有意义的功效。在这些实验中观察到最小肿瘤体积缩小(小于起始肿瘤的10%)(S7A和S7B的补充)。在单个25 mg/kg剂量下持续的抑制下，Osimertinib的功效显示与磷酸化EGFR下游信号标志物有关(图5C；补充图S8)。虽然阿法替尼和厄洛替尼显示出相似的药效学效应，但对于磷酸化EGFR而言，单一剂量，磷酸化AKT的吸收和磷光体-S6R的作用 osimertini的抑制作用更强。(图5C；补充图5c)。增强磷酸化AKT抑制和磷酸化S6R抑制有助于提高Osimertinib的活性，是我们未来研究的课题。
我们进一步研究了两种药物对肿瘤的抑制反应
EX20SIns变体PDX模型(LXF 2478 M 766_A767insASV和LU0387 H773_V774insNPH)
LXF2478模型 一天一次给药阿法替尼(20 mg/kg)，Osimertinib(25 mg/kg)和AZ5104(25 mg/kg)敏感，与对照组相比，分别有87%(P<0.001)和81%(P<0.001)的肿瘤生长抑制(14天测量)(图5D)。在LU0307模型中，每日一次给予Osimertinib(25 mg/kg)和AZ5104(50 mg/kg 7天，25 mg/kg)，诱导15天对肿瘤生长抑制率分别为71%(P<0.001)和86%肿瘤缩小(P<0.001)。(图5E)。在单独的研究中，每天服用25 mg/kg的AZ5104与对照组相比，在第15天 7%的缩小(P<0.001)(补充图S7C)。这两种化合物都耐受性良好，并观察到最小肿瘤体积缩小并给药前开始肿瘤体积进行比较((补充图S7D和S7E)。
总的来说，这些结果表明，Osimertinib及其代谢物AZ5104在多个不同的EX20Is PDX模型中与阿法替尼相比在体内具有更高的活性，并且进一步支持Osimertinib在各种EGFR EX20Is突变肿瘤患者中的潜在作用。
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