科学家如何认识到是DNA的甲基化影响柳穿鱼花的形态和小鼠毛色？
2021/7/2 11:36:00 生命科学教育
介绍表观遗传时，新教材选用了柳穿鱼花形态和小鼠毛色两个实例。这里可能师生们还是会有疑问：科学家是怎样了解到两个例子都与DNA的甲基化有关呢？
1柳穿鱼花的形态与Lcyc的甲基化
1.1
现象→疑惑
通常柳穿鱼的花是两侧对称的(野生型)，但部分柳穿鱼的花是辐射对称的(突变型)。考虑到花的对称类型是形态学分类的重要依据，都是柳穿鱼却开出了不同对称类型的花，这对科学家而言特别惊奇。
(引自文献1)
于是，人们将开两侧对称花的柳穿鱼与开辐射对称花的柳穿鱼杂交，子一代柳穿鱼都是两侧对称花；再将子一代种下去得到子二代，子二代有两种：一种开辐射对称花，数量比较少；还有一种开两侧对称花，数量比较多。你也许会感觉这与孟德尔一对相对性状的杂交实验挺像的。但不幸的是：子二代开两种花的柳穿鱼比例并不是3：1；并且F2中的两侧对称花与亲代的两侧对称花也不完全相同，而是可以明确区分为多种不同的形态。
1.2
线索→聚焦Lcyc基因
金鱼草(Antirrhinum)也会开两种花：一种两侧对称，一种辐射对称。并且研究已经得知：金鱼草花的对称类型由cyc基因控制。于是，我们很自然地会猜测：柳穿鱼中是不是也存在类似的基因呢？
(图片引自网络，侵权删)
科学家在柳穿鱼DNA中找到了与cyc基因相似度高达87%的核苷酸序列，这应该就是我们寻找的目标了。为了和cyc基因区别开来，我们将柳穿鱼中类似的核苷酸序列称为Lcyc基因。
1.3
Lcyc基因有差别吗？
接下来的问题就是野生型柳穿鱼(开两侧对称花)和突变型柳穿鱼(开辐射对称花)在Lcyc基因的碱基序列上有没有差异呢？这只需要将野生型和突变型柳穿鱼的DNA序列比对一下就可以了，如下图所示。
(引自文献1)
先解释一下这个图，图中只给了该基因一条链的碱基序列，这是科学文献常用的表示方法。虽然DNA是双链的，但两条链中的碱基是互补配对的，因此知道其中一条链的碱基序列，另一条链的碱基序列也就可以确定了。科学家约定只写基因中非模板链的碱基序列，之所以写非模板链而不是模板链的，是因为非模板链与mRNA中碱基序列大致相同，只要把非模板链中的T替换成U就是mRNA的碱基序列了。
比较野生型和突变型柳穿鱼的Lcyc基因的碱基序列，我们能够发现两者只有一个碱基的差异，而且这个差异碱基并不在编码序列中；两者的编码序列是完全一致的，也就是说突变型和野生型柳穿鱼中的Lcyc基因虽然存在差异，但两者如果都得到表达的话，表达的蛋白质是一样的。
1.4
差异在哪里？→新线索
科学家又研究了Lcyc基因的表达情况，基因表达时需要先转录产生mRNA。实验结果发现：在不同的发育阶段，野生型柳穿鱼中Lcyc基因可以在特定的部位表达；而突变型柳穿鱼在不同发育阶段均未检测到Lcyc基因的表达。这表明野生型和突变型柳穿鱼中Lcyc基因的表达情况是不同的，这又是什么原因导致的呢？
(引自文献1，深色表示Lcyc发生了转录)
1.5
继续寻找差异
科学家接下来又用Lcyc基因进行限制酶酶切分析。限制酶能够在特定部位将DNA分子剪切开。图示为Lcyc基因中部分限制酶的酶切位点。
(酶切图谱改编自文献1，酶切片段均能和探针杂交，在电泳后均显示条带，故探针未示意)
给出的这一段DNA两端有两个HindⅢ酶切位点，两个HindⅢ酶切位点之间有2.4kb(碱基对)。两个HindⅢ切位点之间还有两个PstⅠ酶切位点。
我们会看到：如果用同时HindⅢ和PstⅠ两种酶一起进行完全酶切，结果就会产生1.5kb、0.7kb和0.2kb三种大小的DNA片段。不过PstⅠ酶切位点中的胞嘧啶如果发生甲基化的话，就不能再被PstⅠ酶切了。如果只是前一个PstⅠ位点发生甲基化，那么两种酶完全酶切会产生2.2kb和0.2kb两种DNA片段。如果只是后面一个PstⅠ酶切位点发生甲基化，那么两种酶完全酶切会产生1.5kb和0.9kb两种DNA片段。如果两个PstⅠ酶切位点都发生甲基化，那么两种酶完全酶切只会产生2.4kb的DNA片段。
酶切产生的大小不同的DNA片段可以通过电泳进行分离。现在我们看一下野生型和突变型柳穿鱼Lcyc基因酶切后的电泳结果。
(引自文献1)
与野生型(图中“+”)柳穿鱼相比，突变型(图中“P”)均缺少了1.5kb和0.7kb两种大小的DNA片段。为什么在突变型柳穿鱼中1.5kb和0.7kb两种片段消失了呢？
没有出现1.5kb的原因应该是前一个PstⅠ酶切位点发生了甲基化，导致原来的酶切位点没有被切开；同理，没有出现0.7kb片段的原因是两个PstⅠ酶切位点中至少有一个发生了甲基化。
因此，我们能够初步判断：与野生型柳穿鱼相比，突变型柳穿鱼的Lcyc基因发生了甲基化。
1.6
更进一步的实验证据
为了更进一步检验上述结论，科学家又用限制酶MboⅠ和Sau3A进行酶切。这两种限制酶的酶切位点相同，差别在于它们对甲基化的敏感程度存在差异。MboⅠ对甲基化敏感，若酶切位点的胞嘧啶发生甲基化，就不能继续酶切；而Sau3A对甲基化不敏感，酶切位点的胞嘧啶即使发生了甲基化，仍可以继续剪切。
显然，如果MboⅠ/Sau3A酶切位点没有发生了甲基化，MboⅠ和Sau3A分别酶切的结果应该是相同的；如果酶切位点发生了甲基化，两种酶的酶切结果就是不同的。
(引自文献1)
从图示结果来看，野生型(“+”)柳穿鱼中MboⅠ和Sau3A的酶切结果一致，这就表明在野生型柳穿鱼中MboⅠ/Sau3A酶切位点没有发生胞嘧啶的甲基化。突变型柳穿鱼(“P”)中两种酶的酶切电泳结果是不同的，这就表明突变型柳穿鱼中MboⅠ/Sau3A酶切位点发生胞嘧啶甲基化。
本实验再次表明：与野生型柳穿鱼相比，突变型柳穿鱼的Lcyc基因发生了甲基化。
现在已经确定：Lcyc基因在野生型柳穿鱼中得到了表达，而在突变型柳穿鱼中没有表达；与此同时，野生型和突变型柳穿鱼在Lcyc基因上存在甲基化水平的差异。此时我们很自然地就会把Lcyc基因的表达与Lcyc基因的甲基化联系起来，并作出如下判断：突变型柳穿鱼中Lcyc基因的不表达，可能就源于该基因的甲基化。
02
小鼠毛色与Avy的甲基化
2.1
现象→疑惑
小鼠的毛色有黄色和黑色之分，通常纯种黄色小鼠的基因型为AA，这里A基因的表达产物负责合成黄色素；纯种黑色小鼠的基因型为aa，a基因的表达产物负责合成黑色素。
科学家在实验室中培育出了另一种黄毛色的小鼠，这种小鼠体内含有Avy基因，Avy was created by the insertion of an intracisternal A-particale(IAP) retrortransposon into an upstream non -coding exon of agouti，即Avy是在基因座agouti(A基因所在的位置)的上游插入了一段反转座子序列。科学家已经知道：Avy基因和A基因在编码序列上是一致的，即Avy和A的基因表达产物都能负责合成黄色色素。
科学家发现基因型为Avya的小鼠(C57BL/6)并没有相同一致的表型，而是表现为一系列从黑色到黄色的过渡类型。考虑到Avy的表达产物负责合成黄色色素，而a的表达产物负责合成黑色素，我们很自然地会做出如下猜测：Avya小鼠表现为一系列过渡类型源自黄色色素的含量不同。
(引自文献2)
这里为了叙述方便，我们把黑色稍带一点点的黄色称为伪黑色(pseudoagouti)，把黄色和黑色混杂称为斑驳色(mottled)。显然伪黑色小鼠(Avya)中Avy基因的表达水平较低，黄色色素较少；而斑驳色小鼠(Avya)和黄色小鼠(Avya)中Avy基因表达的水平逐渐升高，黄色色素也逐渐增多。
为什么这些个体的基因型同样都是Avya，但是Avy的表达水平却不同呢？
2.2
线索→聚焦Avy的甲基化
实验室中除了从基因A出发培育得到基因Avy，还得到了基因Aiapy和基因Ahvy，Aiapy、Ahvy和Avy都在基因A前面插入了IAP序列，并且研究已经确认：在Aiapy和Ahvy小鼠中，涉及到IAP序列的甲基化。因此，科学家怀疑：Avy是不是也发生甲基化了呢？
(引自文献2)
2.3
Avy酶切预备知识
我们来看一下Avy的酶切图谱。这里示意了Avy涉及的两种限制酶BamHⅠ和MspⅠ的酶切位点。为了更好地示意酶切结果，我们还将电泳结果与探针杂交，探针只能够和与其互补的序列发生碱基配对。如果只用BamHⅠ进行完全酶切得到片段①，由于片段①不含有和探针配对的序列，因此电泳得到的片段①就不能和探针进行杂交，在电泳图谱中就不会显现出来，这可以帮助我们忽略不值得关注的DNA片段。
(酶切图谱改编自文献2)
表所示的实验中用到了四种表型的小鼠：黑色(aa)、伪黑色(Avya)、斑驳色(Avya)和黄色(AvyAvy)。每种表型的小鼠都做三组酶切：一组单独使用BamHⅠ(“-”表示)，一组同时使用BamHⅠ和MspⅠ(MspⅠ在表中用M表示)，一组同时使用BamHⅠ和HpaⅡ(HpaⅡ在表中用H表示)。
黑色小鼠(aa)的酶切电泳结果代表a基因。分析伪黑色(Avya)和斑驳色(Avya)两组实验结果时，我们可以在电泳条带中减去代表a基因的条带(黑色小鼠那一组的)，这就当于从Avya(伪黑色或斑驳色)中去掉了a，剩下的条带就代表了Avy的酶切结果。
酶切时使用BamHⅠ的目的是把9.7kb那一段DNA切下来。酶切使用的另外两种限制酶HpaⅡ和MspⅠ，它们的酶切位点相同，但是对甲基化的敏感性不同。HpaⅡ对酶切位点的胞嘧啶甲基化敏感，而MspⅠ对酶切位点的胞嘧啶甲基化不敏感。因此两种酶酶切同一段DNA时，如果酶切结果相同，则表明该段DNA在HpaⅡ/MspⅠ酶切位点没有发生甲基化；如果酶切结果不同，则表明该段DNA在HpaⅡ/MspⅠ酶切位点发生了甲基化。
2.4
酶切分析→甲基化
(酶切电泳图引自文献2)
从实验结果中可以看到：伪黑色组(Avya)中BamHⅠ+MspⅠ和BamHⅠ+HpaⅡ两组的酶切结果不同，这表明Avy在HpaⅡ/MspⅠ酶切位点发生了甲基化；同理，斑驳色组(Avya)中Avy在HpaⅡ/MspⅠ酶切位点也发生了甲基化。
那么，伪黑色组(Avya)和斑驳色组(Avya)中Avy甲基化程度有差异吗？
从实验结果可以看到伪黑色组(Avya)经BamHⅠ+HpaⅡ酶切电泳后能得到9.7kb的DNA片段，而斑驳色组(Avya)经BamHⅠ+HpaⅡ酶切电泳后9.7kb的片段消失了，亦即9.7kb片段在斑驳色组(Avya)中被酶切了。考虑到HpaⅡ对甲基化敏感，据此可以判断：斑驳色组(Avya)的9.7kb片段中部分MspⅠ/HpaⅡ的酶切位点没有发生甲基化，HpaⅡ可以将9.7kb剪切成更小的片段(图中介于9.7kb和3.5kb的条带)；伪黑色组(Avya)的9.7kb片段中MspⅠ/HpaⅡ的酶切位点发生了甲基化，9.7kb难以被剪切仍以大片段的形式存在——这样我们就能看到：与斑驳色组(Avy高表达)相比，伪黑色组(Avy低表达)中Avy的甲基化水平更高，即甲基化水平越高，Avy的表达水平越低。
2.5
甲基化可以遗传吗？
为了研究Avy的甲基化能不能遗传给下一代？科学家又用不同表型的Avya小鼠与黑色小鼠(aa)杂交，实验结果如图所示。为了示意的简洁性，亲子代中的黑色小鼠(aa)都未在图示中给出。
(引自文献2)
我们能够看到a组和b组的差异在于测试的Avya小鼠用作父本(a组)还是母本(b组)。在a、b组内又分别有3组实验。a组内的3组实验中：测试用小鼠(Avya)的表型存在差异，根据上述分析已知：Avy的甲基化水平不同会导致不同的表型，因此这里具有不同表型的Avya小鼠，实际上可以理解成Avy甲基化水平不同的小鼠。b组内的3组实验可以类似分析。
先分析a组。在父本Avy甲基化程度有差异的情况下，子代的表现基本没有差异，也就是说在自变量(Avy的甲基化水平)改变时，因变量并未随之发生变化，这就说明父本中Avy甲基化不会传递给子代。
再分析b组。在母本Avy甲基化程度有差异的情况下，子代的表现也出现了差异，也就是说在自变量改变时，因变量也随之发生改变，这就说明母本中Avy甲基化好像可以传递给子代。
根据本实验，我们可以推测：Avy的甲基化可能通过母本传递，而不能通过父本传递。
03说明
文献1=Pilar Cubas，Coral Vincent & Enrico Coen：An epigenetic mutation responsible for natural variation in floral symmetry. Nature，1999：157-161.
文献2=Hugh D. Morgen， Heidi G.E. Sutherland，David I.K. Martin et al.：Epigenetic inheritance at the agouti locus in the mouse. Nuture Genetics，1999：314-318.
选用两种酶切位点相同的限制酶，但是它们对甲基化的敏感性不同，这已经成为分析DNA甲基化的标注操作。现在已经可以对基因组甲基化进行分析。
视频讲解链接：表观遗传的两个实例
源网页 http://weixin.100md.com
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