市场频现“召回”事件，竟是“GTI”的锅，基因毒性杂质如何评估与控制？
2023/3/21 16:40:00 药智网
近几年以来，医药市场频频出现制剂中被检出“基因杂质残留”而被召回的事件，例如最具代表意义的2018年缬沙坦风波：“FDA发现缬沙坦中含有微量亚硝胺(NDMA)基因毒杂质，导致缬沙坦从整个市场被召回，导致华海药业陷入史上最大低谷”
那么究竟何为基因毒性杂质，其又有何影响力能左右企业之未来？
01
监管要求，GTI意义非凡
基因毒性杂质(也称遗传毒性杂质，GTI)，是指化合物本身直接或间接能够引起DNA突变、染色体断裂或者DNA重组的物质，严重威胁人类健康，需要严格控制药物中这类杂质的限度，也因此备受各国监管机构重点关注。
从原理分类上来讲，其主要分为PGLS(有潜在基因毒性的杂质)与GTLs(基因毒性杂质)两种，而根据ICH指导原则以及美国药物研究和制造商协会(PhRMA)发布的白皮书，将基因毒性杂质分为更严格的五类：
图片来源：参考来源3
而包括ICH在内，全球如FDA、EMA等各国的法规机构对基因毒性杂质都提出了明确的要求，无论仿制药还是创新药企业在研发过程、生产过程或是生产变更转移的过程中都对GTI的控制和检测表现出愈加强烈的关注度，目前国内应用较普遍的指导原则主要有ICH M7指导原则、2020 版《中国药典》四部通则中新增的《遗传毒性杂质控制指导原则》以及药审中心各项针对性细分指导原则(亚硝胺类杂质等)。
但是，落实到实际应用上，到底如何通过对相关法规的理解，在药品研制过程中对致突变杂质识别、评估、分类和控制策略制订，控制药品安全性风险，却依旧是大多数企业头痛的问题。而也正是因此，医药各界关于基因毒性杂质讨论也愈发多了起来，更种会议、沙龙、直播成为各企业相关负责人趋之若鹜的存在。
恰如，博腾股份3月21日就将在“博药”公众视频号开展的题为“基因毒性杂质的评估与控制策略制定”的直播，就邀请了博腾股份小分子事业部研发分析总监余鹏，就如何对基因毒性杂质评估和控制策略制订等内容进行分享。
02
GTI监控，从警示性结构开始
其实，对于GTI而言，理论上绝大多数药物都存在或多或少的残留基因毒性杂质，如何高效、合理地对GTI监控、检测及分析才是药企最关注且必要的思考之处。
目前来讲，虽说市面上用于检测基因毒性的分子学手段越来越多，但一方面由于药物中杂质非常微量，且检测量与成本的问题始终存在，所以根据法规与指导原则采用警示结构来区分普通杂质与基因毒性杂质是最常见的做法。
具有代表性的基因毒性杂质或者
潜在基因毒性杂质结构
图片来源：参考来源5
而所谓“警示结构”，简单来讲就是指导原则、数据库中已知的可能与遗传物质发生化学反应的特殊基团，因此具有潜在的致癌风险。对于含有警示结构的杂质，应当进行(Q)SAR预测和体内外遗传毒性和致癌性研究，或者将杂质水平控制在毒理学关注阈值(TTC)之下。
但同时，含有警示结构却又并非一定具备遗传毒性，具备遗传毒性却又不一定一定具备警示结构，因为杂质自身性质和结构特点也会对其毒性产生抑制或调节作用。警示结构的作用更多是用于提示可能存在的遗传毒性和致癌性，为进一步的杂质安全性评价与控制指明方向，类似于高效、便捷的筛选过程。
03
GTI检测方法选择，核心在“因性制宜”
随着各种分子学应用以及相关科技水平的上涨，关于基因毒性杂质测定方法的研究也随之逐步加深。
原则上，由于低浓度检测时辅料、高浓度的原料药干扰以及高反应活性的基因毒性杂质不稳定等诸多因素影响，导致GTI分析不仅需要高灵敏度的分析仪器，还要求检测方法的多样选择性，往往同一种基因杂质甚至需要多种检测手段同时进行，而同一种检测方法很难检测出所有的基因毒性杂质。
目前来讲，分析方法可以根据基因毒性杂质的挥发性分为两大类，即液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)，而传统的HPLC法或GC法灵敏度较低，仅适用于含量高且溶解性好的原料药，之后也有其基础上诞生了更多新类型的检测方法。
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首先，由于灵敏度和选择性要求高，常规的液相和气相方法(如GC、HPLC等)，达不到检测药物中痕量基因毒性杂质的灵敏度要求，多选用液质联用技术和气质联用技术进行测定；
其次，很多基因毒性杂质反应活性比较强或者不稳定，不能直接进行测定，一般通过衍生化法将其转化为稳定的化合物，然后进行测定，同时也能够达到提高检测灵敏度的目的；
此外，药物成分复杂，可能会引起基质效应，影响测定结果的准确性，一般通过各种萃取技术如LLE、SPE、LSPE和SPME等对样品进行分离、纯化和富集，然后进行分析测定，不仅能够提高检测灵敏度，还能减少基质效应，获得更好的测定结果。
另外，针对挥发性杂质的GC方法，还需要重点考虑何种进样方式，
顶空进样：适用于挥发性大的组分分析，可以减少样品的前处理步骤，减少样品分解对于目标杂质的干扰影响，优点是基质干扰小、进样重复性好，缺点在于由于杂质的分配系数原因导致基质对定量准确性可能产生影响。
直接进样：适用于多数热稳定性好的组分分析，优点是能够在进样口气化的化合物，进样方式简单方便，缺点在于进样重复性差，并且长期检测会导致仪器污染的可能性大大增加。
若样品制备时，采用液液萃取、基质沉淀法，虽不能提高方法的灵敏度，却能一定程度上减少样品对设备的污染。
此外，非挥发性杂质中如果无机阴/阳离子(叠氨酸、亚硝酸、澳离子等)和有机离子(生物胺、有机酸、糖类分析等)则可以采用离子色谱法(IC法)。
总之核心概念围绕一点：“不同性质的基因毒性杂质，采取不同的检测方法”。
04
总 结
最后，以基因毒性杂质控制的一个整体思路来做总结：
首先，对工艺路线涉及的杂质来源进行评估；
其次，对评估出的杂质是否存在致癌性风险或是否具备警示结构有初步判断；
之后，根据杂质分类，考虑杂质残留限度、阈值，并使用可靠、多样的分析手段进行针对性的分析检测。
期间严格把控每个环节涉及的关键因素，如此才能从源头避免文首提到的药品召回风险!
参考来源：
[1] 汪生，杭太俊.药物中基因毒性杂质检测策略的研究[J].中国新药杂志，2019,28(23):2840-2846.
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[3] 张芮腾，青旺旺，廖星星，徐小力，何丹.药物中基因毒性杂质检测方法研究进展[J].中国医院药学杂志，2021,41(03):327-332.
[4] 李靖坤，王珊珊，林云良，王晓利，陈相峰.气相色谱-质谱联用法测定对甲苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法学验证[J].当代化工，2017,46(02):378-380.
[5] 王萍，徐彩虹，陈仙，胡爱玲，楼朝，金秀芳，龚俊强，陈轶群.原料药中基因毒性杂质控制的研究进展[J].中国现代应用药学，2015,32(01):119-126.DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2015.01.032.
来源 | 博药(药智网获取授权转载)
撰稿 | 万叶
责任编辑 | 八角
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