Science研究重磅来袭！朱平教授团队发现强直性脊柱炎新抗原！
2023/4/13 20:27:59 医学界风湿免疫频道
*仅供医学专业人士阅读参考
蛋白质翻译后修饰，这种发病分子新机制能否在其他自身免疫病中找到？
撰文｜姚小燕
2023年3月17日，空军军医大学西京医院朱平教授团队在国际顶尖学术期刊Science期刊发表了题为：Cysteine carboxyethylation generates neoantigens to induce HLA-restricted autoimmunity 的研究。
蛋白质翻译后修饰(Post translational modifications，PTMs)是指蛋白质翻译后的化学修饰。PTMs已被证明是一种改变蛋白质结构和功能以产生新抗原并诱导后续自身免疫反应的关键机制。先前的研究已经证实，瓜氨酸修饰肽是RA新抗原的重要来源。然而，强直性脊柱炎(AS)新抗原形成和致病自身反应的分子机制在很大程度上尚不清楚。迫切需要开发一种系统的方法来分析AS患者中可能诱导后续自身免疫反应的PTMs。
朱平教授团队发现了一种全新的蛋白质翻译后修饰——半胱氨酸羧基乙基化修饰。整合素αIIb[ITGA2B(CD41)]的半胱氨酸残基在一个需要肠道微生物代谢物3-羟基丙酸(3-HPA)的过程中被羧乙基化修饰，并导致产生了致病性新抗原(该抗原下文称为ITGA2B-ceC96)，被证明是HLA-DRB1*04呈递的一种新的致病性抗原，可引起HLA限制性自身免疫反应。当用ITGA2B-ceC96肽免疫携带人类HLA-DR4等位基因的转基因小鼠时，引起了结肠炎和脊椎骨侵蚀。这项研究破解了AS发病的分子新机制。
这个AS的致病新抗原是如何发现的呢？让我们一起来看看。
目录
1.通过泛蛋白修饰组学搜索引擎发现AS患者PBMC中富集的氨基酸衍生物——半胱氨酸羧基乙基化修饰
2.半胱氨酸羧乙基化修饰需要3-HPA作为反应底物和胱硫醚β合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)催化
3.半胱氨酸羧乙基化诱导ITGA2B的溶酶体降解，从而产生促发AS患者HLA限制性适应性免疫反应的新抗原
4. 动物实验：3-HPA联合羧基乙基化抗原肽免疫HLA-DR4转基因小鼠，可诱导小鼠出现结肠炎肠炎及脊柱侵蚀样病变
5.患者人群的验证：AS、RA、SLE患者以及健康人的ITGA2B-ceC96含量和代谢情况如何？
1.通过泛蛋白修饰组学搜索引擎发现AS患者PBMC中富集的氨基酸衍生物——半胱氨酸羧基乙基化修饰
研究采用了泛蛋白修饰组学搜索引擎，以开放式搜索方法来测定AS患者外周血单个核细胞(PBMC)中的氨基酸残基和衍生物，发现半胱氨酸+72.021修饰在AS患者的外周血单个核细胞中显著富集, 其中，δ质量为72.021的氨基酸衍生物在AS患者中增加最多。如图1所示：
图1：半胱氨酸+72.021修饰在AS患者的外周血单个核细胞中显著富集
其中，δ质量为72.021的氨基酸衍生物主要发生患者整合素蛋白的第96位半胱氨酸上(ITGA2B@96Cys+72.021)。尽管检测到ITGA2B中87、96、161和718位的四个不同半胱氨酸残基，但只有Cys96(半胱氨酸的羧乙基化)修饰的ITGA2B，即ITGA2B 96C+72.021，在AS患者中显著增加。
2. 半胱氨酸羧乙基化修饰需要3-HPA作为反应底物和CBS催化
3-HPA是一种肠道微生物释放的代谢物。体内外实验表明，半胱氨酸羧乙基化修饰需要3-HPA作为反应底物(图2)，在CBS的催化下，通过与半胱氨酸羧侧链巯基的脱水反应生成羧乙基硫醚。
图2.体外实验表明，半胱氨酸羧乙基化需要3-HPA作为底物
3.半胱氨酸羧乙基化诱导ITGA2B的溶酶体降解，从而产生促发AS患者HLA限制性适应性免疫反应的新抗原。
为了研究ITGA2B-ceC96肽是否可以作为新抗原并触发HLA限制性适应性免疫反应，研究者对126名AS患者和40名健康捐献者的血浆样本进行了分析。与健康供体组相比，AS组抗ITGA2B-ceC96自身抗体水平明显更高。此外，AS组中至少有10名患者的水平高于健康供体组的最高水平，这10名患者均携带与AS相关的HLA-DRB1*04等位基因。
随后，该研究描述了如何验证ITGA2B@96Cys+72.021修饰作为AS相关的自身抗原，并研究半胱氨酸羧乙基化抗原诱导的MHCII依赖型CD4+ T细胞反应。研究表明，半胱氨酸羧基乙基化修饰肽可作为新生抗原，并可以被MHC II复合物HLA-DRA*01/HLA-DRB1*04提呈至细胞膜表面。ITGA2B-ceC96肽被特异性募集到HLA-DRA*01-HLA-DRB1*04复合物的抗原结合槽中, HLA-DRB1*04基因型患者确实产生了羧基乙基化特异性自身抗体和T细胞应答。因此，ITGA2B-ceC96(84-110)肽仅限于促进HLA-DRB1*04的抗原特异性T细胞反应，这可能是和HLA-DRB1*04有利于修饰肽的呈递有关。
图3.HLA-DR4限制性免疫反应由羧乙基化的ITGA2B肽触发
4. 动物实验：3-HPA联合羧基乙基化抗原肽免疫HLA-DR4转基因小鼠，可诱导小鼠出现结肠炎肠炎及脊柱侵蚀样病变
动物实验表明，3-HPA联合羧基乙基化抗原肽免疫HLA-DR4转基因小鼠，可诱导小鼠出现结肠炎肠炎及脊柱侵蚀样病变。如图4所示：
图4：半胱氨酸羧乙基化修饰产生新抗原诱导HLA限制性自身免疫。当用ITGA2B-ceC96肽免疫携带人类HLA-DR4等位基因的转基因小鼠时，引起了结肠炎和脊椎骨侵蚀
5.患者人群的验证：AS、RA、SLE患者以及健康人的ITGA2B-ceC96含量和代谢情况如何？
为了进一步研究半胱氨酸羧乙基化的起源，研究者还分析了来自AS、RA和SLE患者以及健康对照(HC)的共110个PBMC样本 。
在AS、RA和SLE患者的PBMC中检测到羧乙基化的ITGA2B，AS患者PBMC中羧乙基化ITGA2B水平显著高于健康供体。此外，与HCs相比，AS、RA和SLE患者血浆中的ITGA2BceC96特异性自身抗体水平显著升高。
但和RA或SLE患者不同的是，AS患者的CBS水平升高，但RA或SLE患者的CBS含量没有升高，因此，AS患者的3-HPA和相关代谢途径显著增强。
临床数据显示，半胱氨酸羧基乙基化修饰与患者体内3-HPA水平和抗-ceC96自身抗体相关，尤其是在HLA-DRB1*04阳性患者中。因此，半胱氨酸羧乙基化的关键驱动因素3-HPA和ITGA2B-ceC96特异性免疫反应似乎仅在AS中发挥重要作用。
图5. AS、RA、SLE患者和HC中ITGA2B-ceC96相关代谢和免疫变化的综合分析
总的来说，体外和体内实验表明，整合素αIIb的半胱氨酸残基(ITGA2B)的羧乙基化由CBS催化，该过程需要3-HPA，这是一种通常由肠道微生物释放的代谢物。半胱氨酸羧乙基化诱导ITGA2B溶酶体降解，并产生触发MHC-II依赖CD4+ T细胞反应的新抗原，ITGA2B-ceC96肽可以作为新抗原并触发HLA限制性适应性免疫反应。该研究进一步加深了对AS发病机制的理解，并可能有助于AS和其他自身免疫性疾病的诊断和治疗。
“医学界风湿免疫频道”邀请到了空军军医大学西京医院朱平教授对研究进行深入解读，精彩不容错过，快来一起看看～
Q
能否请您介绍一下该研究发布的背景及意义？
朱平教授
一直以来，AS的发病机制尚不明确。既往研究成果提示抗原提呈细胞、树突状细胞或巨噬细胞的功能障碍，与该病发病机制相关。例如有研究显示内质网应激反应可能会促进大量产生HLA-B27，或HLA-B27分子错误折叠并形成二聚体等异常，可能被特异的NK细胞、CD4+T细胞识别，加上其他遗传表达或微生物等多种因素作用下，引起大量免疫细胞活化或细胞因子产生，都可能与AS患者的附着点炎、骨骼的增生破坏及肠道受累等症状有关。但CD8+T淋巴细胞如何识别抗原？其抗原肽是否存在？获得性免疫如何启动？AS最关键的问题仍未被解决。尽管现在均认为关节炎既是自身炎症，也是自身免疫性疾病，但实际对自身炎症的了解相对更多，而对于其自身免疫相关机制了解较少。此研究的目的便是在寻找AS可能的致病抗原，从此次研究结果来看，新抗原与肿瘤相关疾病的抗原并不一样，新抗原经过翻译后修饰的加工后，是否便是自身免疫病的重要抗原，是否可能是AS新抗原？此次研究也同样想启动一种能筛选这类抗原的机制，在我们实验过程中，经过一系列筛选及体内外的各种实验证实，确认新抗原是存在的。新抗原不仅可以被体内外各种细胞免疫特异性T细胞识别，也能通过新抗原在特定老鼠模型上，重现AS相关症状，例如特异性脊柱炎及肠炎症状。Q
本研究为AS等自身免疫病的发病和诊疗提供了哪些启发？
朱平教授
虽此次研究重点在于AS，但我们也观察到RA、SLE患者体内也存在这类新抗原。因此通过这个实验，实际启动了一套筛选、证明新抗原的实验体系，能通过同样的方法筛选其他自身免疫病的抗原，为其研究提供帮助。
Q
研究表明， AS、RA和SLE患者血浆中的ITGA2B-ceC96特异性自身抗体水平均显著升高，而ITGA2B-ceC96特异性免疫反应似乎仅在AS中发挥重要作用？为什么RA或SLE患者的CBS含量没有升高呢？
朱平教授
因为在识别这种新抗原过程中，存在MHC限制——一种限制自身免疫的机制。另外此次研究重点在AS，对于相同机制是否可能在其他自身免疫性疾病中存在，我们将在今后的研究中深入进行探索。
Q
新的致病抗原的发现需要经过层层推敲和严密的验证过程，这个过程中，您有遇到什么困难吗？
朱平教授
首先，此次研究从筛选、证实及后续体内外实验，既往都未实际操作过。另外，所有实验及层层验证都需要形成实验体系，例如动物模型均是自主设计，因为需要涉及T细胞及HLA相关基因限制。因此实验纳入的患者也需要进行长期追踪，后续仍需筛选特定基因型的患者来进行验证。
专家简介
朱平 教授
主任医师、教授，博士研究生导师，博士后指导教师，空军军医大学特聘高级专家全军风湿免疫专科研究所所长国家分子医学转化科学中心-个体化医学研究所所长中国免疫学会临床免疫分会副主任委员及陕西分会主任委员全国卫生产业企业管理协会风湿病与分子免疫分会会长陕西省医师协会风湿免疫医师分会主任委员等学术任职
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参考文献：[1]Zhai Y, Chen L, Zhao Q, et al. Cysteine carboxyethylation generates neoantigens to induce HLA-restricted autoimmunity. Science. 2023;379(6637):eabg2482. doi:10.1126/science.abg2482
本文作者：姚小燕
本文审核：朱平教授
本文责编：芋子
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