【最新发现】诺如病毒传播的一条新途径
2022/7/7 14:30:17 生物密探

    

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     每年，诺如病毒、轮状病毒和星状病毒在发达国家和发展中国家共感染约10亿人，导致显著的发病率和死亡率。

     大多数非细菌性胃肠炎暴发是由人类诺如病毒引起的。这些病毒具有高度传染性，因为即使是少数颗粒也会导致疾病，并且受感染的个体会排出大量病毒。

     诺如病毒

     诺如病毒属属于卡利西病毒科，仅包含一个物种，诺沃克病毒;该物种分为至少六个基因群，这些基因群进一步细分为至少30个基因型。已知来自GI、GII和GIV基因组的病毒会感染人类。在过去十年中，GII.4基因型病毒引起了大多数临床病例。尽管是新出现的GII。P17-GII.17基因型最近成为亚洲部分地区的主要菌株。

     人类诺如病毒具有约7.5 kb的非分割阳性链RNA基因组，其中包含三个ORF(如下图)。这些ORF编码大型非结构多蛋白(ORF1)，主要结构蛋白VP1(ORF2)和次要结构蛋白VP2(ORF3)。二十面体病毒颗粒衣壳由VP1的90个二聚体组成，由壳(S)结构域和突出(P)结构域组成。P结构域负责与组织血型抗原(HBGA)结合，HBGA在宿主细胞上作为受体或共受体起作用，并且它含有抗原性的重要决定因素。病毒颗粒仅包含VP2的几个拷贝，其与VP1的S结构域形成的衣壳内表面有关。目前，没有获得许可的诺如病毒疫苗，但大多数疫苗策略都集中在VP1上。

    

     诺如病毒基因组有三个ORF，它们编码多蛋白 - 包括六个单独的非结构蛋白 - 以及结构蛋白VP1和VP2。基因组以正义RNA链((+)RNA的形式封装在由VP1和VP2形成的衣壳中。衣壳通过VP1和宿主组织血型抗原(HBGA)之间的相互作用附着在细胞表面(步骤1)，随后被内化，未包被和拆卸(步骤2，3)。然后(+)RNA被转录并翻译在宿主细胞的细胞质中。翻译由宿主翻译因子介导，这些因子由非结构病毒蛋白VPg招募，其共价结合到基因组的5'末端(步骤4)。由ORF1编码的多蛋白被病毒编码的蛋白酶Pro(也称为NS6或3C样)翻译后切割(步骤5)成单个蛋白质：p48(也称为NS1 / 2或N项)，NTP酶(也称为NS3或2C样)，p22(也称为NS4或3A样)，VPg，Pro和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。在基因组复制过程中，(+)RNA被转录成负义RNA((?)RNA)，分别用作合成新基因组和亚基因组(+)RNA的模板(步骤6)。亚基因组(+)RNA仅包含ORF2和ORF3，用于生产VP1和VP2。在封装(步骤7)期间，基因组 - 以及可能的亚基因组 - (+)RNA被包装成新的病毒粒子，随后从受感染的宿主细胞中释放出来(步骤8)，尽管释放发生的机制仍然很大程度上是未知的。

     诺如病毒等肠道病毒长期以来一直被接受为通过粪便-口腔传播在人群中传播：病毒从一个宿主排出粪便并进入另一个宿主的口腔，绕过唾液腺(SG)到达肠道进行复制，在粪便中脱落并重复传播周期。

     近日，Ghosh等人提供了胃肠道病毒唾液感染途径的有趣证据，报告肠道病毒有效且持续地感染SG，达到与肠道相当的滴度。证明肠道病毒被释放到唾液中，确定了病毒传播的第二条途径。研究以“Enteric viruses replicate in salivary glands and infect through saliva”为题，于6月29号发表在《自然》杂志上。

    

     唾液是抵御许多通过口腔途径进入的病原体的第一道防线，可以反映个体的临床状态。唾液检测通常用于诊断几种感染SG的病毒，例如爱泼斯坦 - 巴尔病毒，狂犬病病毒，单纯疱疹病毒以及严重急性呼吸综合征冠状病毒1和2。诺如病毒、轮状病毒和星状病毒基因组RNA在有症状和无症状个体的唾液中经常被检测到。这些观察结果被解释为肠道污染物，因为这些病毒被认为主要通过摄入受污染的食物和水通过粪便 - 口腔途径传播，并在肠道中有效复制。

     吸吮将肠道病毒传播给母亲

     新生小鼠幼崽(小于10天大)是研究肠道感染的极好模型，因为它们的消化道和免疫系统不成熟使它们容易受到病毒的影响。事实上，当用小鼠诺如病毒1型(MNV-1)或轮状病毒(婴儿小鼠的动物流行病性腹泻(EDIM))和通过中位组织培养感染剂量(TCID)测量复制时，很容易检测到肠道感染。(MNV-1)或定量PCR(qPCR)(EDIM)。在幼犬肠道中观察到MNV-1(图1b)和EDIM(图1c)的强健肠道复制，两种病毒在接种后3至5天(dpi)达到峰值，清除7-10 dpi。在成年小鼠中也获得了类似的发现。

    

     图1：乳吸感染的幼崽直接将肠道病毒传播到母亲的乳腺。

     a，口服接种MNV-1或EDIM的小鼠幼崽与母亲(水坝)一起喂养。b，接种后幼牙中的MNV-1滴度。c，接种后在幼犬肠道中复制EDIM。d，MNV-1和EDIM感染幼崽的肠道sIgA。b–d，n = 3个生物独立实验数，每个实验七只动物;每个点代表一只动物。e，水坝的牛奶sIgA(n = 3，每个病毒三个水坝;每个点代表一个实验)。f，在吸吮MNV-1或EDIM接种的幼崽的母乳腺中病毒复制(n = 3，每个病毒23只动物;每个点代表一只动物)。g-n，对吸吮未接种或MNV-1-或EDIM接种的幼崽的母腺进行免疫染色。o，产后十天的水坝用EDIM口服接种。p，在o的乳腺和肠道中进行EDIM复制(n = 3，8只动物，3只用于6 hpi和2 dpi，两个用于每个实验的4 dpi;每个点代表一只动物)。q，来自口服接种EDIM的水坝的牛奶sIgA(n = 3，每个点代表一个实验)。r，幼犬/水坝交换实验方案。s，t，EDIM水平在水坝(s)的乳腺和幼崽的小肠(t)(n = 3，每个实验包括两个笼子，每个笼子由一个水坝和两只幼崽组成;每个点代表一只动物)。数据是 s.e.m. b–d，e，f，p，q，双尾未成对 t 检验的平均±。统计资料见补充表4。6 hpi (b，c，f) 和 day-0 (d，e，p，q) 值被用作起始输入值。TCID 检测限 (LOD) 的计算50和 qPCR 在方法中进行了描述。在图 1–3 中，TCID 的 LOD50每毫升约为102;qPCR数据的LOD为每毫克组织78±9(s.e.m.)基因组拷贝。

     像所有哺乳动物幼崽一样，幼崽依靠乳汁来获得关键的免疫成分，例如分泌性IgA(sIgA)，它是由哺乳母亲的乳腺产生的(在小鼠中称为dams)。牛奶sIgA通过帮助幼崽对抗肠道感染来保护幼崽，这些幼崽在接近断奶之前无法产生自己的sIgA。作者观察到幼犬小肠sIgA水平的快速峰值从MNV-1或EDIM的3 dpi开始(图1d)，这与母亲的乳汁sIgA水平的快速峰值相关(图1e)。首先，这些实验中使用的所有大坝都是EDIM / MNV-1血清阴性(未显示)。当作者分离出大坝乳腺时，发现大约10个5与输入相比，MNV-1和EDIM基因组RNA丰度增加一倍，表明乳腺肠道病毒复制(图1f)。通过分别针对EDIM和MNV-1非结构复制蛋白NSP5和NS4的抗体对大坝乳腺进行免疫染色证实了这一点，这些抗体分别鉴定出乳管内衬的上皮细胞(图1g，h，k，l)和B细胞(图1i，j，m，n)作为EDIM和MNV-1的复制位点。

     作者测试了乳腺中的复制和乳汁sIgA的快速激增是否是由于水坝通过传统的粪 - 口途径被幼崽感染，因为共享生活空间中可能存在共食。众所周知，怀孕和哺乳期间的肠 - 乳腺途径会导致免疫细胞(尽管不是病毒)在肠道感染或接种疫苗时从肠道转移到乳腺。作者在产后10天用EDIM口服EDIM血清阴性母体(无幼崽)(图1o)，并测量乳腺和小肠(图1p)和牛奶sIgA(图1q)中EDIM基因组RNA的水平。与吸吮受感染幼崽的水坝(图1d-f)相反，口服接种的幼崽的乳汁中没有sIgA激增(图1q);他们的乳腺没有显示任何可检测的病毒RNA(图1p)，而他们的小肠有106-病毒RNA增加4 dpi的倍数(图1p)。

     为了进一步询问这种病毒转移模式，小鼠幼崽口服EDIM接种(幼崽A)并放回母乳(dam A)上吸吮。在1 dpi时，他们的母亲被从未接种的幼崽(幼崽B)的笼子中与寄养水坝(dam B)交换。大坝A与幼崽B一起放置并吸吮，而幼崽A则由大坝B吸吮(图1r)。在3 dpi下，杀死两个笼子中的所有动物，并测量母乳腺(图1s)和幼犬小肠(图1t)中的病毒复制。作者找到了一个 104-大坝A和B的乳腺中病毒基因组水平增加一倍(图1s)和106-比输入(约10)在幼崽A和B的小肠中基因组水平增加一倍(图1t)2每毫克组织的基因组拷贝数)。这表明，大坝A和B都是通过吸吮直接接种的幼崽A而感染的，大坝A在之后的几天内与幼崽A和大坝B一起感染了1 dpi。幼崽B可能是通过母亲A受感染的乳腺或粪便的吸吮而感染的。总的来说，这些发现表明，肠道病毒通过吸吮从幼崽回流到母亲的乳腺，导致原位乳腺感染和乳汁sIgA激增的快速触发，这可能有助于清除幼崽的感染。6.

     肠道病毒通过唾液传播

     作者测试了唾液是否可能是吸吮期间肠道病毒传播到乳腺的管道。从成年小鼠中提取唾液(因为这比从幼鼠中提取唾液更容易)21用EDIM或MNV-1口服接种(图2a)。抗EDIM轮状病毒VP6(图2b)和抗MNV-1 VP1(图2c)的免疫印迹显示每种病毒从2 dpi开始排出唾液;MNV-1 断续器50测量结果显示，3 dpi 时滴度约为 104-比输入高一倍(接种后6小时(hpi))(图2d)。而MNV-1和EDIM感染是急性的，并在7-10天内清除(图1b，c)，MNV-3，MNV-4和特征不太好的WU23小鼠诺如病毒株持续感染近端结肠并排入粪便数周。作者用这些菌株接种小鼠，发现所有菌株在接种后也持续在唾液中脱落至少3周，滴度约为103-比输入高 (6 hpi) 的倍数(图 2e)。

    

     图2：肠道病毒在SG中急性和持续地复制，并通过唾液传播。

     a、唾液采集示意图。b，c，分别从EDIM感染的(b)或MNV-1感染的(c)小鼠中收集唾液，分别用抗VP-6和抗VP1探测(n= 3，每个实验五只动物)。d，唾液中的MNV-1滴度(n = 3，每个实验三只动物;每个点代表一个实验)。e，WU23，MNV-4和MNV-3唾液滴度(n = 3，每个实验四只动物;每个点代表一个实验)。f，小鼠SMG的示意图。i，j，幼犬(i)(n = 4)和成人(j)SMG(n = 3)中的EDIM复制。g–j，每个数据点代表一只动物，每个实验七只动物。中棉中的 k、WU23、MNV-4 和 MNV-3 滴度(n = 3，每个实验五只动物;每个点代表一只动物)。l–n，在接种了WU23(l)，MNV-4(m)和MNV-3(n)的成年小鼠的SGs，近端结肠，Peyer斑块和脾脏中的复制(n = 3，每个实验五只动物;每个点代表来自一只动物的数据)。o，口服感染唾液的示意图。p，病毒在口服接种受感染唾液的幼崽的小肠中复制(n = 3，每个点代表一只动物，总共六只动物)。还为幼崽接种了未感染的唾液作为基线参考。数据是 s.e.m. d，e，g–j，k，双尾未成对 t 检验±平均值。统计资料见补充表4。有关凝胶源数据，请参见补充图1。d，e，g–k，l–n 的输入为 6 hpi。

     肠道病毒在SG中的复制

     主要的SG复合体(图2f)由腮腺、舌下腺和下颌下腺(SMG)组成。选择SMG作为代表性SG，因为它们是最大的，并提供基底唾液分泌。在用MNV-1，MNV-3，MNV-4或WU23菌株口服接种幼崽和成人后，大约104在SMG中测量了滴度比每种病毒各自输入水平(6 hpi)增加的倍数(图2g，h，k)。复制对2′-C-甲基胞苷(2-CMC)诺如病毒聚合酶抑制剂也敏感。同样，在EDIM和小鼠星状病毒接种的SMG中小鼠，约10只5- 和 103分别测量病毒基因组拷贝的倍数增加(图2i，j)。值得注意的是，对于MNV-3，MNV-4和WU23，SMG复制的水平和持续时间与近端结肠相当(图2l-n)。相比之下，病毒RNA水平显着降低，并最终从Peyer的斑块和脾脏中清除(图2l-n)。作者还测试了CR6鼠诺如病毒，其VP1和NS1 / 2蛋白分别与MNV-3和MNV-4关键序列基序共享全身感染和持久性所需的VP1和NS1 / 2蛋白。CR6没有在SMG中复制，指出持久性鼠诺如病毒株之间的差异。

     除了吸吮之外，作者还测试了唾液是否可以通过传统的口服途径将感染传播给他人。用从MNV-1或EDIM感染的成年人获得的唾液口服接种幼崽(图2o)，并以3 dpi测量肠道病毒基因组水平。这显示出显着的EDIM和MNV-1复制(图2p)，如口服接种粪便EDIM或MNMV-1的幼崽(图1b，c)。

     在免疫细胞和上皮细胞中复制

     TCID₅₀测量结果显示CD45免疫和EpCAM(上皮细胞粘附分子)上皮SMG细胞群中显着的MNV-1滴度(图3a，b)。通过用针对MNV-1复制报告基因NS4和双链RNA(dsRNA)(J2)和上皮(EpCAM)和免疫细胞(CD45)标记物的抗体进行共免疫染色证实了这一点(图3c-f)。将NS4染色定位到腺泡上皮细胞(图3f，g)，用NKCC1标记。EDIM也在CD45和EpCAM SMG细胞群中复制(图3h)，但后者的复制主要在导管上皮细胞中(图3g，i，j)。

    

     图3：小鼠诺如病毒和轮状病毒在SMG的上皮和免疫细胞中复制。

     a，b，上皮(EpCAM)和免疫(CD45)细胞中的MNV-1滴度，从接种的幼崽(a)和成年(b)的SMG中分类(n= 3，每个点代表来自两只动物的数据，总共六只动物)。c-f，未接种和MNV-1接种的幼崽的SMG的免疫染色，具有抗NS4，抗J2(dsRNA)，抗EpCAM和抗CD45。MNV-1在腺泡(箭头和盒子1)和免疫细胞(盒子2)中复制。g、唾液管结构示意图。h，从接种的幼崽的SMG中分类的EpCAM和CD45细胞中的EDIM复制(n = 3，每个点代表两只动物，总共六只动物)。i，j，从未接种的(i)和EDIM接种的(j)幼崽中免疫染色抗NSP5，抗CD45和抗EpCAM。免疫细胞(框 1)和导管细胞(箭头和框 2)中的 EDIM 复制。k，Cd300lf在SMG中的表达(n = 3，每个实验三个成人和三个幼崽)。RAW246.7和HeLa细胞分别用作阳性和阴性对照。l， MNV-1滴度在接种Cd300lf的SMG中++++?/?和Cd300lf小鼠(n = 3，每个点代表一只动物，每组每个实验五只动物)。m，MNV-1滴度在接种的SG去除或SG完整的成年小鼠的肠道中(n = 3，每个点代表一只动物，每组每个实验六只动物)。

     Cd300lf，编码所有已知小鼠诺如病毒株的功能性肠道受体，在SMG EpCAM和CD45细胞群中也高度表达(图3k)。Cd300lf++?/?接种MNV-1的小鼠幼崽没有显示出其SG的任何生产性感染(图3l)，表明CD300lf受体对于小鼠诺如病毒感染SMG至关重要。值得注意的是，在口服MNV-1接种之前从成年小鼠中部分提取SG导致肠道感染的更快清除(图3m)。这些数据，加上MNV-3 / MNV-4 / WU23持久性(图2e，k-n)和相对于肠道的急性病毒从SMG中清除速度较慢(图2g-j)(图1b，c)，表明SG可能充当肠道病毒库。

     离体唾液复制模型

     病毒复制的体外模型是研究病毒生命周期，治疗方法和疫苗的重要工具。作者研究了球体是否由小鼠SG细胞(唾液球)组装而成。可用作鼠肠病毒的离体培养系统。在EDIM接种的唾液球中，测量了EDIM基因组RNA拷贝在12 hpi和48 hpi之间增加了十倍(图4a，b)。由于唾液球内源性表达CD300lf，用MNV-1接种它们。这导致2-CMC敏感复制(图4c)和MNV-1以48 hpi出口到培养物上清液中(图4d)。CR6在体内的SMG中没有复制，在唾液层中可靠地复制。

    

     图4：肠道病毒在唾液球和SG细胞系中复制。

     a，在盐球中接种MNV-1或EDIM的示意图。b，EDIM接种的脂球裂解物中的EDIM基因组拷贝(n = 4)。c，MNV-1在具有2-CMC的唾液球中复制(n = 3)。d， MNV-1-接种的脂球上清液中的MNV-1滴度(n = 3)。e， NS-SV-TT-DC接种方案与HuNoV.f，用抗NS7和抗VP1探测的P0细胞裂解物的免疫印迹。β-肌动蛋白被用作负载控制(n = 3)。p0和P4细胞裂解物(g)和P4上清液(h)中的g，h，HuNoV基因组RNA水平(n = 3)。i，粪便滤液中TIM-4磁珠的囊泡拉取方案11.j，囊泡覆盖或游离病毒接种的NS-SV-TT-DC培养物的细胞裂解物中的HuNoV基因组RNA水平(n = 3)。k，通过抗NS7(n = 3)和抗β-肌动蛋白进行免疫印迹分析囊泡覆盖或游离病毒接种的NS-SV-TT-DC培养物的细胞裂解物。l，m， FISH在未接种(l)和囊泡覆盖的HuNoV(GII.4-WN)接种(m)NS-SV-TT-DC和NS-SV-TT-AC细胞培养物上对(?)HuNoV链进行探针。单元格轮廓以黄色显示;箭头指向(?)HuNoV RNA。n，NS-SV-TT-DC和NS-SV-TT-AC细胞与(?)HuNoV链鱼染色的百分比(n = 6)。数据是平均值±s.e.m. b–d，g，h，j，k，n，每个点代表一个生物学上独立的实验;两组间双尾不成对 t 检验。统计资料见补充表4。d，g，h，j，k，输入为6 hpi。b，c，g，h，j， qPCR 的 LOD 为 102基因组拷贝 ml?1.d， TCID 的 LOD50每毫升为 2 × 102.

     唾液细胞系复制人诺如病毒

     目前用于复制人诺如病毒(HuNoVs)的人肠和B细胞培养模型需要补充剂(胆汁酸和微生物群)，并且成本高昂。因此，作者测试了HuNoV是否可以在人类SG细胞系中复制。作者选择了SV40转化的贴壁唾液细胞系，NS-SV-TT-DC(导管)和NS-SV-TT-AC(腺泡)，它们通常作为单层生长并使其适应无血清培养基。将导管NS-SV-TT-DC细胞接种固定体积的HuNoV粪便滤液(GII.4 Sydney)(图4e)，该滤液在6 hpi下洗掉。在洗涤后收集的P0裂解物和免疫印迹与针对衣壳VP1和聚合酶NS7的抗体显示两种蛋白质在输入(6 hpi)上的时间依赖性增加，表明复制(图4f)。接下来，将HuNoV依次通过NS-SV-TT-DC细胞传代四次，每次在新培养物中接种前一传代的上清液，以6 hpi洗涤接种物并在96 hpi下收集细胞裂解物或上清液(图4e)以测量HuNoV基因组拷贝(图4g，h)。在P0中，作者测量到细胞内HuNoV(每毫升基因组拷贝数)在6至96 hpi之间增加了约1，000倍。尽管通过P4复制已经减弱，细胞内和细胞外病毒水平分别比每种病毒的输入(6 hpi)高约100倍(图4g)和十倍(图4h)，但测量的复制接近于肠类培养中报告的复制。

     轮状病毒和诺如病毒作为囊泡内的病毒簇从细胞非溶解状态地排出。与游离粪便病毒(例如，由于囊泡裂解)相比，囊泡覆盖的病毒可以免受粪便蛋白酶和核酸酶的侵害，从而实现高感染倍增性(MOIs)并导致感染率增强。事实上，只有囊泡外衣、富含HuNoV的接种在导管和腺泡唾液细胞系中有效复制，qPCR、病毒非结构蛋白的免疫印迹(NS7、NS6)和单分子荧光原位杂交(FISH)证明了这一点。针对(?)复制的HuNoV RNA链(图4i–n)。这一发现可能对增强其他HuNoV培养模型的传染性有影响。

     作者已经证明，SG是这些病毒的重要复制位点，与肠道相当;唾液将感染传播给他人，包括哺乳期的母亲。此外，性结核糖可能起到贮藏作用，从而在没有腹泻的情况下继续通过唾液传播肠道病毒。研究的结果将重点放在SGs和唾液的肠道病毒感染上，与公认的传播模式，粪便污染相比，通过说话，咳嗽，打喷嚏和接吻的潜在更重要的传播途径。因此，作者的研究结果表明，除了防止粪便传播的措施外，可能还需要卫生措施来防止肠道病毒在人群中的传播。

     这对受感染的婴儿尤其重要，他们的唾液在吸吮过程中通过回流将肠道病毒直接传播到母亲的乳腺。这避开了传统的肠道- 乳腺轴线，并导致母乳分泌性 IgA 抗体迅速激增。最后，证明了SG衍生的球体和细胞系可以复制和传播肠道病毒，生成可扩展且可管理的生产系统。

     总的来说，研究揭示了肠道病毒的新传播途径，对治疗，诊断和重要的卫生措施具有重要意义，以防止通过唾液传播。

     参考资料：

     1.Ghosh， S.， Kumar， M.， Santiana， M. et al.肠道病毒在唾液腺中复制并通过唾液感染。自然 (2022).https://doi.org/10.1038/s41586-022-04895-8

     2.de Graaf， M.， van Beek， J. & Koopmans， M. 人类诺如病毒在不断变化的世界中的传播和进化。Nat Rev Microbiol 14，421–433 (2016).https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.48

    

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