Science Advances|细胞表面SARS-CoV-2核衣壳蛋白调节先天性和适应性免疫
2022/8/9 15:46:17 生物密探
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尽管高效疫苗的开发和部署空前迅速，但快速选择严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)棘突糖蛋白(S)抗体(Ab)逃逸突变体有可能推迟恢复到大流行前的状态。为了扩大疫苗接种范围并减少与SARS-CoV-2相关的急性和慢性疾病，提高我们对CoV的先天性和适应性免疫的认识至关重要。 CoVs编码四种主要结构蛋白。S，膜(M)和包膜(E)蛋白定位于病毒表面包膜中。N通过静电相互作用与病毒RNA结合，形成与M结合的细胞质螺旋核衣壳，使病毒萌芽进入早期分泌室。作为表达最丰富的SARS-CoV-2蛋白，N诱导强Ab和TCD8+免疫反应。虽然CoV N被广泛认为严格定位于细胞质中，但RNA病毒N的细胞表面表达与其说是例外，不如说是规则。单克隆Abs(mAbs)的早期研究报告了甲型流感和水疱性口炎病毒N的表面表达。N型流感是Ab补体介导的细胞裂解和Ab重定向的T细胞裂解的靶标，并且被小鼠中的保护性Abs靶向。N样和N样RNA基因组结合蛋白在感染了其他人类病毒的细胞表面表达，包括麻疹，呼吸道合胞体，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎和人类免疫缺陷病毒。近日，一篇题为：“细胞表面SARS-CoV-2核衣壳蛋白调节先天性和适应性免疫”的研究，发表在《Science Advances》上。报道了人类CoV N在细胞表面的表达及其在先天性和适应性免疫中的参与。
SARS-CoV-2 N在受感染的细胞表面稳定表达通过对感染后24小时(hpi)的Vero细胞与野生型(wt)或表达增强型绿色荧光蛋白(SARS-CoV-2)的重组SARS-CoV-2(SARS-CoV-2_eGFP)进行成像来检查SARS-CoV-2 N的细胞表面表达。为了专门检测细胞表面N，在固定和安装之前，在4°C下将原代和荧光团偶联的继发Abs孵育活细胞以进行共聚焦成像。这揭示了在模拟感染(模拟)背景水平上的透明表面N染色，使用S或eGFP作为感染细胞的标志物(图1A，z堆栈的最大强度投影图像)。同样在BHK-21_hACE2(人血管紧张素转换酶2)，Caco-2，Calu-3，CHO-K1_hACE2和HEK293-FT_hACE2细胞的表面发现了N，这些细胞在24 hpi下感染了wt或eGFP SARS-CoV-2(图。S1 和 S2，电影 S1 到 S14，动画 S1 到 S14)。根据细胞类型，观察到N和S之间的共定位程度不同，在Vero(图1A)，Calu-3，CHO-K1_hACE2和HEK293-FT_hACE2细胞中尤其显着(图。S1)。注意到据报道，hACE2过表达BHK-21_hACE2和HEK293-FT_hACE2细胞中出现了明显的合胞体形成。
图 1.SARS-CoV-2 N在感染早期在活细胞表面表达。(A)激光共聚焦显微镜z-stack图像的最大强度投影感染的Vero细胞与wtSARS-CoV-2(顶部)或SARS-CoV-2_eGFP，以24 hpi(MOI = 1)活体染色。比例尺，20 μm。图像代表了至少三个具有相似结果的独立实验。DAPI， 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。(B)流式细胞术分析接种了wt(顶部)或eGFP表达(底部)SARS-CoV-2(MOI = 1)的Vero细胞，以24 hpi活体染色对抗SARS-CoV-2 S和N蛋白。流式细胞术分析的代表性点图显示表面S，N和eGFP蛋白的双重染色，表明双重染色的每个象限的门控细胞群的百分比。数据代表至少三个独立实验，每个实验都用一式三份样本进行。(C 和 D)在活的受感染的Vero细胞中表面S，N和eGFP蛋白表达的时间过程，其中wt(C)和eGFP报告基因(D)SARS-CoV-2在8和12 hpi(MOI = 1)下。流式细胞术分析中表面 S、N 和细胞内 eGFP 蛋白的代表性直方图叠加。数据代表至少两个独立实验的一个实验，一式三份。为了更定量地测量N表面表达，对活感染细胞24 hpi进行了流式细胞术分析。在所检查的七种细胞类型中的每一种的表达S-或eGFP的细胞亚群上检测到表面N(图1B和图1。S1 至 S3)。在感染了α(B.1.1.7)，β(B.1.351)和Delta(B.1.617.2)SARS-CoV-2变体的活细胞表面也检测到N(图1.S4)。通过流式细胞术，测定了Vero(图1，C和D)，BHK-21_hACE2和A549_hACE2细胞表面N表达的动力学(图1，C和D)(图1，C和D)。S5)。早在8 hpi时，在活Vero和BHK-21_hACE2感染的细胞中观察到N蛋白的显着表面信号，而A549_hACE2细胞需要稍长(12 hpi)(图)。S5)。值得注意的是，根据细胞类型和感染标志物(S与eGFP)，在一小部分细胞上检测到表达N但不表达S或eGFP的细胞，范围从不到1%到43%(图。S1 和 S2)。这与单独或组合作用的几种机制一致：SARS-CoV-2基因产物在单个细胞中的差异表达(12)，分泌途径中S的完全保留(13)，以及N从感染细胞转移到未感染细胞。为了确定N细胞表面表达是否需要其他SARS-CoV-2基因产物，用编码N的表达质粒转染细胞，活BHK-21，CHO-K1或HEK293-FT细胞转染显示，与表达eGFP的对照质粒转染的细胞获得的背景水平相比，N mAb结合高达7倍(图2A 和图。S6A)。转染后24至72小时，N表面表达增加，为染色的特异性提供了进一步的证据，并证明细胞表面表达是生物合成N的固有特性。
图 2.SARS-CoV-2 N细胞表面结合独立于其他病毒基因，并由硫酸乙酰肝素/肝素特异性介导。
(A)用编码eGFP或N蛋白的质粒瞬时转染的细胞中表面N蛋白表达的动力学的直方图半叠加，通过流式细胞术用Abs检测。hpt，转染后数小时。(B)外源性rN与不同细胞结合的分析的直方图叠加，与纯化的eGFP或rN蛋白一起孵育15分钟，用Abs染色，并通过流式细胞术分析。(C)用阳离子聚合物(聚苯乙烯)进行电荷中和测定。将细胞与50ng rN蛋白孵育15分钟，然后用聚丁二烯(10μg/ ml)孵育，用Abs染色，并进行分析。(D)将不同GAG缺陷的CHO细胞与eGFP或rN蛋白孵育15 min，用Abs染色，并通过流式细胞术分析。(E)肝素酶治疗显着抵消了细胞结合和保留N蛋白的能力。用肝素酶处理的不同细胞的直方图半覆盖1小时，与50ng rN蛋白一起孵育15分钟，用Abs染色，并分析。(F) BLI 传感器图，从硫酸化 GAG 的高通量筛选结合试验到固定化的 N 或 eGFP 蛋白。SA涂层生物传感器加载等量的N或eGFP，测量其结合每个GAG的能力。传感器图显示关联和分离阶段，其中垂直虚线表示关联步骤的结束。在(C)和(D)中，绘制了来自活细胞的检测到的表面N蛋白的平均荧光强度(MFI)，显示了SEM±均值(n = 2)。学生的双尾不成对t检验用于比较N孵育细胞与N孵育和聚丁二烯处理的细胞(C)，并比较GFP-与N-孵育细胞(D)：ns(统计上不显着)P>0.01，**P<0.01，***P<0.001。使用不同的蛋白质制剂重复分析，并显示至少三个独立测定的一次代表性测定，一次重复进行。
外源性N与细胞结合为了检查N表面表达是否需要其在细胞中的合成，将BHK-21，CHO-K1或HEK293-FT细胞与外源纯化的重组N(rN)在37°C下孵育15分钟。这导致相对于与不相关蛋白质孵育的对照细胞相比，抗N mAbs具有强烈的流式细胞术染色(2对数位移)(图2B和图。S6B)。N通过高带正电荷的RNA结合结构域(14，15)与带负电荷的病毒RNA相互作用。通过用聚丁二烯处理rN包被的细胞来检查基于电荷的N结合，聚苯乙烯是一种中和表面静电电荷的阳离子聚合物。流式细胞术分析表明，聚苯乙烯将与活的BHK-21，CHO-K1，HEK293-FT和A549_hACE2细胞结合的rN降低到相似的水平，其效应的大小与结合的N的量成正比(图2C)。
对于大多数哺乳动物细胞，糖胺聚糖(GAGs)是质膜上带负电荷的主要分子(16)。为了评估GAG对N细胞表面结合的贡献，使用了一组GAG缺陷的CHO细胞(17)。测试的每个GAG缺陷细胞系都未能在重组GFP观察到的水平上结合rN(图2D)。该小组包括完全没有GAG(CHO-pgsA-745和CHO-pgsB-618)的细胞，以及在合成硫酸乙酰肝素和肝素方面有缺陷的细胞，但没有其他GAG(CHO-pgsD-677和CHO-pgsE-606)。与这些发现一致，将Vero，BHK-21，Calu-3，A549_hACE2，CHO-K1或HEK293-FT细胞与肝素酶I，II和III联合治疗，以解聚硫酸肝素/肝素多糖链以二糖，细胞显着减少外源性rN的结合(图2E和图。S6C)。通过使用生物层干涉测量(BLI)直接确认N与肝素的结合，其中直接证明了N特异性纳摩尔亲和力与硫酸乙酰肝素和肝素的结合，而不是与其他硫酸盐GAG的结合(图2F和图。S6、D 和 E)。总之，这些发现表明N通过以电荷依赖性方式与硫酸乙酰肝素和肝素相互作用而与细胞表面结合。
N从表达细胞转移到非表达细胞在SARS-CoV-2免疫荧光和流式细胞术实验中，24 hpi(图1，A和B以及图1，A和B以及图。S1和S2)，观察到细胞表达N但不表达S或GFP早在8和12 hpi(图。S5)，感染后细胞数量随时间增加(图.S7)。为了确定N是否可以从受感染的细胞转移到未感染的细胞，将SARS-CoV-2添加到可感染(表达hACE2)和非感染(非表达hACE2)CHO-K1细胞的共培养中，比例为1可感染的细胞与9个不可感染细胞的比例。证实，hACE2是用SARS-CoV-2感染CHO细胞所必需的(图2)。S8A)。用CellTrace紫罗兰色预染了不可感染的细胞，以便在共培养后实现明确的流动鉴定(图。S8B)。共培养的非ACE2表达未感染的CHO-K1细胞(也通过缺乏S表达证实)具有比感染细胞更高的细胞表面N信号(图3A和图。S8C)。来自受感染细胞的氮转移需要在未感染的细胞上表达GAG，如GAG缺陷的CHO细胞的近背景染色所示(图3，B和C，以及图。S8、D 和 E)。N也从HEK293-FT或BHK-21细胞中转移，从转基因瞬时表达N到共培养的未转染细胞(图.3D)。扩展这些发现，发现来自SARS-CoV-2感染细胞的N被转移到由3μm孔径过滤器分离的不可感染细胞中，最终确定细胞 - 细胞收缩不需要转移到细胞表面(图。S9)。基于这些发现，得出结论，N蛋白合成导致其从细胞中释放，并且至少部分通过扩散将其稳健地转移到非合成细胞，其中它通过结合肝素/硫酸乙酰肝素保留在细胞表面。
图 3.SARS-CoV-2 N蛋白被转移到邻近未感染细胞的细胞表面。流式细胞术分析供体和受体共培养细胞之间的氮转移测定。(A至C)可感染和不可感染共培养细胞之间的N转移测定。CHO-K1(A)，GAG缺陷CHO-pgsA-745(B)和CHO-pgsB-618(C)细胞(不可感染)，单独或与CHO-K1_hACE2细胞(可感染)共育(cc)，接种SARS-CoV-2(MOI = 1)并用Abs以24 hpi活活染色，对抗表面SARS-CoV-2 S和N蛋白。在与可感染细胞共培养之前，用CellTrace紫罗兰染色非感染细胞(图1S8)。对于显示表面S和N的双重染色的点图以及每个象限的门控细胞群的百分比，请参见图。S8(C 至 E)。(D)转染和未转染共培养细胞之间的N转移测定。HEK293-FT和BHK-21细胞用编码eGFP或N蛋白的质粒瞬时转染。24小时后，未转染的HEK293-FT或BHK-21细胞用CellTrace紫罗兰染色，然后加入并与转染的对应物共培养。用Abs活体染色24小时后对细胞进行染色并进行分析。对于每种测定，图中显示了以下内容：绘制了表面N和S蛋白的直方图叠加和半叠加，以及表达S和N蛋白的活细胞的几何MFI(GMFI)或MFI，显示了SEM±均值(n = 3)。图中显示了至少三个独立实验一式三份进行的一个代表性实验。使用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnet的多重比较测试来比较所有条件与每个测定中单独培养的不可感染细胞或eGFP转染细胞：ns P >0.05，**P <0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
SARS-CoV-2 N抑制趋化因子功能，但能够激活基于Ab的免疫细胞N在受感染和周围细胞表面的稳健表达表明具有显着的进化功能。与大多数病毒一样，SARS-CoV-2诱导受感染细胞释放促炎细胞因子。N会干扰这个信号吗？通过BLI检查了固定化N与64种人类细胞因子相互作用的能力。N结合的CCL5，CCL11，CCL21，CCL26，CCL28，CXCL4，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL12β和CXCL14趋化因子具有微摩尔至纳摩尔亲和力(图4A和图1。S10)。相比之下，测试的其他SARS-CoV-2固定化结构(S，M和E)或非结构[开放阅读框(ORFs)3a，3b，6，7a，7b，8，9b，9c，9c和10]蛋白均未与面板中的任何细胞因子相互作用，其亲和力高于固定GFP观察到的亲和力(图。S11A)。N与每种趋化因子结合的动力学曲线是双相的，偏离了一阶结合(1：1)，并显示出结合异质性(图1.S10) (18).
图 4.SARS-CoV-2 N蛋白调节先天性和适应性免疫。(A和B)N通过其GAG结合结构域结合趋化因子并抑制体外趋化因子介导的白细胞迁移。(A)结合测定的BLI传感器图显示N蛋白与11个阳性结合的趋化因子之间的相互作用的关联和解离阶段，浓度为100 nM的64个测试的人细胞因子。虚线表示关联步骤的结束。使用不同的纯化rN蛋白制剂重复分析。显示了三种独立测定的一种代表性测定。(B)SARS-CoV-2 N阻断MonoMac-1细胞，MOLT-4细胞和人PBMCs的CXCL12β趋化性。CXCL12β单独或在经溶室迁移装置的下腔室中存在指示的病毒蛋白的情况下孵育。在实验结束时，在下腔室中检测到来自顶部腔室的迁移细胞。迁移诱导显示从至少三个独立测定的三份三份进行的一种代表性测定中±SEM(n = 3)的装置。使用单因素方差分析和Dunnet的多重比较检验将所有条件(对照组除外)与单独趋化因子诱导的迁移(彩色条)进行比较：ns P >0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。(D)N蛋白是Ab基免疫的靶标。ADCC报告基因生物测定在SARS-CoV-2感染的Vero和BHK-21_hACE2靶细胞(24 hpi，MOI = 1)上使用针对N蛋白和Jurkat效应报告细胞的降低浓度的人mAb进行。过夜孵育后，测量荧光素酶表达以测量细胞活化。数据显示意味着±三次进行三个独立实验的代表性测定的SEM(n = 3)一式三份。虚线表示在没有Ab. RLU(相对荧光素酶单位)的情况下检测到的背景信号。趋化因子功能基于与表面GAG及其位于白细胞表面的特异性受体的相互作用。发现，通过增加硫酸乙酰肝素(来自牛肾)和硫酸软骨素A和B N与其趋化因子亚群的结合浓度来阻断趋化因子的GAG结合域(图。S12)。这表明N通过其GAG结合结构域与趋化因子结合。N-趋化因子相互作用的功能相关性是什么？单核细胞样细胞(MonoMac-1)，T淋巴细胞样细胞(MOLT-4)和人健康供体外周血单核细胞(PBMC)的Transwell趋化性实验显示，rN在生理相关浓度下阻断CXCL12β诱导的趋化性(图4B)。通过比较感染细胞24 hpi之间的表面荧光来估计感染期间生理释放的N的量(图1)。S3)和与1μM(50ng)rN孵育的细胞(图2E和图2。S6C)，通过在相同条件下进行的抗N Ab染色观察到表面荧光信号的相似增益。因此，在300 nM下对趋化因子诱导的迁移的近乎完全的rN抑制发生在与SARS-CoV-2感染后常规观察到的细胞表面N量相匹配所需的浓度的三倍。虽然来自不同供应商的rN显示出抑制CXCL12β介导的MonoMac-1细胞迁移的可比结果，但S1蛋白(S蛋白的亚基1，含有受体结合结构域)对CXCL12β诱导的趋化性没有抑制作用(图1。S13)。扩展这些发现，来自SARS-CoV-1和中东呼吸综合征(MERS)-CoV的rN也抑制了CXCL12β诱导的MonoMac-1细胞的迁移(图4C)。据报道，小鼠CoV N的mAb在体外(用补体)和体内(19，20)发挥抗病毒活性。为了研究它们作为Ab依赖性细胞毒性(ADCC)靶标的潜力，使用FcγRIIIa受体表达Jurkat报告细胞作为ADCC效应细胞识别抗N mAb包被SARS-CoV-2感染细胞的替代物。Vero和BHK-21_hACE2 SARS-CoV-2感染的细胞以抗N mAb浓度依赖性方式激活报告细胞(图4D)。在没有感染或具有相同重链的对照人单克隆抗体的情况下未观察到激活。总之，这些发现表明来自每种高致病性人类CoV的N蛋白阻断趋化因子功能。这与细胞表面N阻断体内趋化因子功能的可能性一致，促进病毒复制和传播。相反，研究还表明细胞表面N是ADCC的潜在靶标，这可能有助于限制病毒复制和传播。这个研究表明在SARS-CoV-2感染期间合成的N或从转染的互补DNA合成的N在N合成细胞和邻近细胞的表面上表达。N与细胞表面的结合基于与硫酸乙酰肝素和肝素的特异性关联。对这些发现最简洁的解释是，N从细胞中释放出来，并从液相与产生细胞和旁观细胞结合。根据流式细胞术数据，在所检查的七种细胞类型中，除一种细胞类型外，SARS-CoV-2感染细胞上的N水平等于或超过细胞表面S。这部分是由于早期分泌途径中保留了很大一部分S，但也反映了大量细胞表面N，可能在10的范围内4至 105每个单元格的份数。N分泌的机制仍有待确定。N具有两个潜在的位点，用于在分泌途径中添加N连接的寡糖，这些位点被糖基化，并且当N用人工N端信号序列靶向内质网(ER)时很容易检测到。没有信号序列，N不糖基化。这表明，与其他病毒核酸结合蛋白(例如，SV40 T 抗原和流感病毒 N)一样，SARS-CoV-2 N 可能通过非规范分泌途径分泌，这可能是绕过插入 ER 的三种已定义途径之一。像N一样，几种非规范输出到细胞表面的蛋白质(HIV Tat，FGF2和tau)与硫酸乙酰肝素结合，硫酸乙酰肝素已被证明参与穿过质膜。研究N和其他病毒RNA结合蛋白的细胞表面输出以及它们的细胞表面结合在多大程度上基于硫酸乙酰肝素结合将是有趣的。N通常是表达最丰富的SARS-CoV-2蛋白，其向未感染细胞的转移可能会放大其对病毒适应性的贡献。细胞表面N结合趋化因子和阻断免疫效应细胞趋化性的显着能力为其细胞输出和与受感染和邻近未感染细胞的结合提供了进化解释。像N一样，趋化因子通过与GAG结合固定在源细胞及其邻居身上。已知许多病毒表达趋化因子结合蛋白，其通过与趋化因子的GAG或受体结合域或两者相互作用来调节趋化因子活性。研究结果确定SARS-CoV-2 N是第一种CoV趋化因子结合蛋白，一种对多种趋化因子具有极高亲和力(纳摩尔范围)的蛋白质。N与肝素的结合限制了炎症部位的凝血，这表明分泌的N在促进冠状病毒病(COVID)相关的凝血异常中可能起作用。N分别存在于康复和致命COVID-19患者的肠道和肺部，而很少检测到病毒样颗粒，这与这种有趣的可能性一致，并且在导致“长期COVID-19”症状的慢性低水平炎症中的作用一致。仅尖峰疫苗的显着功效表明，ABS至N不是COVID-19保护所必需的。SARS-CoV-2诱导强烈的抗N Ab反应，部分原因是由于季节性CoV感染诱导的记忆B细胞的交叉反应。这些Abs可以减少幼稚个体的SARS-CoV-2疾病，因为我们将N确定为Ab介导的效应器功能的潜在靶标，包括补体和自然杀伤细胞介导的感染细胞裂解。因此，Abs可能在通过免疫接种提供的SARS-CoV-2感染的保护中发挥意想不到的作用，其中N表达载体被认为通过诱导N特异性T细胞起作用。N是一种有吸引力的疫苗靶标，因为它具有很强的免疫原性和比尖峰低得多的抗原漂移。鉴于SARS-CoV-2在S中获得氨基变化的显着能力，这可能特别相关，如最近引入的具有30多个非同源突变的omicron变体所示。总之，这个研究结果表明，N在SARS-CoV-2和其他人类CoV的先天性和适应性免疫中发挥了意想不到的作用，这些作用可能有助于发病机制和保护，并支持N作为未来“通用”疫苗的Ab细胞和T细胞靶标，这些疫苗为未来的SARS-CoV-2和其他人类CoV菌株提供广泛的保护。
文献来源：
1,https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abp9770.
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