持久性细菌如何逃避抗生素，延长感染
2022/11/30 11:36:53 生物密探
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1942年，也就是医生在美国首次使用青霉素的那一年，当时在纽约哥伦比亚医学院工作的微生物学家格拉迪斯·霍比(Gladys Hobby)报告说，这种药物只杀死链球菌培养物中活跃繁殖的细胞。大约1%的细菌似乎在治疗后存活下来。两年后，在爱尔兰都柏林大学的微生物学家约瑟夫·比格(Joseph Bigger)复制了霍比的实验，并将这些幸存的细胞命名为“持久性细胞”。
金黄色葡萄球菌 - 如这张扫描电子显微镜图像所示，其中人类白细胞(蓝色)正在吞噬细菌(洋红色球体) - 是潜在危险细菌感染的常见来源。持久性细胞可能导致感染复发。图片来源：NIAID。
在罗德岛州普罗维登斯的布朗大学研究传染病的一名临床医生—Eleftherios Mylonakis，亲眼目睹了细菌持久性的问题：接受感染治疗的患者，特别是由金黄色葡萄球菌(潜在危险细菌感染的常见来源)引起的感染患者，在完成一个疗程的抗生素后经常复发。更糟糕的是，药物耐受性增加了抗生素的使用，这对患者和持续的耐药性危机都是不利的。
但在发现几十年后，研究人员对持久细胞的起源及其规避策略的性质仍然存在分歧。几乎所有细菌都可以经历物理变化，以对抗生素产生耐受性。然而，与抗生素耐药性的情况不同，一些变化没有编码在任何独特的基因中;耐受性不是一种可以在细菌之间或代际传播的遗传性状。相反，与耐受性相关的变化是短暂的，它们是由任意数量的遗传途径引发的。这些变化通常可以通过调整微生物的环境来逆转。有些人认为转向公差是一个随机过程;其他人则认为潜在的监管机制仍未被发现。
由于缺乏感兴趣的特定基因，研究人员没有太多可做的 - 诸如敲除基因来研究性状之类的工具并不总是有效。实验条件的细微差异可能导致细胞应激，而不是真正的抗生素耐受性。
但近年来，研究人员开始就这些独特细胞的性质达成共识，并强调根除它们的方法。一些研究人员的目标是使细胞对抗生素重新敏感，而另一些研究人员则在寻找在细胞处于休眠状态时消除细胞的方法。还有一些人正在探索宿主免疫反应如何驱动持久性的形成。鉴于细菌持久性的普遍性，这些努力可能被证明对治愈顽固性感染至关重要。没有比这更重要的状态来理解细菌细胞了，因为几乎所有细胞都必须进入这种状态并保持在那里。
缓慢的研究进展但就像细胞本身一样，对持久性现象的研究也休眠了几十年。直到1983年，加州大学欧文分校的研究人员Harris Moyed和Kevin Bertrand报告说，大肠杆菌hipA基因的某些突变，产生一种迫使休眠的毒素，使持久细胞形成的频率增加了近1000倍。但是减少hipA基因的表达并没有完全根除持久性细胞，这一现象导致研究人员探索细菌产生的其他毒素和抗毒素分子如何触发休眠和药物耐受性。对了解耐药性的追求也促使研究人员研究生物膜中的细胞，生物膜是一种复杂的蛋白质和糖基质，围绕细菌并使它们难以杀死。当时普遍的看法是，一旦细胞形成生物膜，就会开启一些特殊的抵抗机制。2010年，刘易斯和他的同事报告说，大肠杆菌中的另一种毒素基因TisB也可能引发耐受性。TisB产生一种小的抗菌肽，该肽进入细菌细胞膜并耗尽其膜电位以及ATP储备，从而将细胞推向休眠状态。当能量储存耗尽时，细菌会关闭蛋白质和肽聚糖的合成以及其他代谢过程 - 所有这些都是各种抗生素的目标。同年，Wood和他的团队在大肠杆菌中发现了另一种毒素，当删除后，会降低持久性。这种名为MqsR的毒素也阻止了蛋白质的合成，但通过破坏mRNA而不是消耗能量。“这个毒素系统没有什么特别的，”Wood说，“关键是停止蛋白质翻译”。其他研究揭示了这一过程中的另一个潜在参与者：信号分子鸟苷(penta)四磷酸[(p)ppGpp]，它激活了其中一些毒素。尽管一些研究表明，停止转录或消耗ATP是持续细胞形成的标志，但其他机制也在起作用。2019年，康涅狄格州纽黑文耶鲁大学的爱德华多·格罗斯曼和毛里西奥·庞特斯发现，酸性环境和低水平的镁离子可以通过减缓细菌生长来驱动沙门氏菌形成持久性细胞。总的来说，这些证据揭示了一个复杂的画面：许多代谢途径可以引导细胞进入持久的状态。尽管这些途径本身可能没有什么共同点，但它们都驱使细胞进入缓慢生长的生理状态。由于大多数抗生素针对与生长相关的细菌过程，因此沉默这些机制有效地阻碍了抗生素杀死细菌的能力。
杀死沉睡的细胞尽管存在不确定性，但研究人员正在研究基于耐药细胞的物理特征的潜在治疗方法。一些方法依赖于复活休眠细胞以使它们对抗生素重新敏感，而其他方法则旨在找到可以在持续状态下杀死细胞的分子。“用于在他们睡觉时杀死它们的化学物质必须能够被动地扩散到细胞中，”Wood说。“一旦它们醒来，它们就和普通细胞一样。没有基因变化，它们很容易被传统抗生素杀死。在发现持久性后不久，Bigan提出了一种方法，该方法依赖于抗生素的“脉冲”剂量，这需要通过暂停来打断治疗，以推动细胞脱离休眠状态。然而，这有“潜在的缺点，因为它会引发耐药性的发展，”刘易斯说，因为反复接触可以使抗生素耐药细菌有机会茁壮成长。相反，Mylonakis，Wood和其他人诱导细菌培养物的持久性，并在高通量筛选中使用这些耐受细胞来鉴定潜在的药物。Wood和他的团队已经筛选了超过10，000种化合物，以研究某些化合物，这些化合物可以通过唤醒细胞起作用，使它们对抗生素敏感，或者在持久性状态下杀死它们。在寻找可以在不唤醒它们的情况下杀死持久细胞的化合物时，Ren和他的团队寻找了批准的抗生素，如eravocycline和minocycline。活跃生长的细胞产生蛋白质，将这些药物从细菌中排出，从而保护微生物免受药物的杀伤作用。但在休眠的大肠杆菌细胞中，这些蛋白质是无活性的，因为它们需要能量才能工作。结果，抗生素在这些细胞内以更高的浓度积累。然后研究小组移除了药物，让休眠细胞再生。但是积累的抗生素在开始恢复正常新陈代谢时杀死了这些细菌。Ren说，寻找以类似方式起作用的药物可能是寻找杀死持久细胞的新方法的一种途径。这些药物必须能够穿过细胞的脂膜并与细胞内靶标紧密结合。如果药物靶点由于休眠而消失，这是行不通的。如果细胞能够在它们醒来后迅速驱逐持久性，这些抗生素可能会失败。传统的药物发现可能会忽略以这种方式工作的分子，因为研究人员通常选择候选药物是因为它们能够杀死或抑制活跃生长的细胞，而不是因为它们杀死昏昏欲睡的持久性的能力。如果用这种逻辑来筛选药物，可能会发现很多以前可能忽略的新候选药物。
感染中的相互作用到目前为止，研究抗生素耐受性的研究人员主要集中在实验室培养物中生长的细菌上，而不是感染的动物模型上。但是宿主免疫反应和细菌之间的相互作用可以影响药物耐受性的发展方式，地点和时间，北卡罗来纳大学教堂山分校的微生物学家Brian Conlon说。“在感染环境中，情况要复杂得多，”他说。“细菌的能量状态实际上将由它与宿主的相互作用驱动。这些相互作用可能因患者而异，也可能在同一人的感染部位之间有所不同。细菌细胞是否能在抗生素治疗中存活取决于它与免疫细胞的相互作用、感染的阶段、营养物质和糖的可用性以及其他几个因素。直到最近，“这真的是未开发的领域，”Conlon说。然而，研究人员最近在理解这些动态方面取得了一些进展。2018年，马萨诸塞州剑桥市哈佛医学院的微生物学家Sophie Helaine和她的同事发现，在沙门氏菌感染的小鼠模型中，持久性细胞并不完全处于休眠状态。他们积极分泌抑制炎症反应的毒素，创造一个环境，一旦抗生素停止，细菌就可以再生。矛盾的是，宿主免疫反应也可以驱动耐受细胞的形成。被称为巨噬细胞的免疫细胞将细菌困在细胞内囊泡内，然后产生一阵活性氧和氮气，通过攻击微生物的呼吸周期来杀死微生物。但在2020年，Conlon和他的同事发现，这种旨在杀死细菌的呼吸爆发可以通过停止细菌能量产生来迫使休眠。在最近的另一个预印本中，研究小组报告说，巨噬细胞在产生炎症反应时消耗更多的葡萄糖。金黄色葡萄球菌的能量水平在很大程度上取决于其获取葡萄糖的能力。因此，当免疫细胞竞争相同的食物时，细菌就无法获得它们，并可能诉诸休眠，抗生素耐受状态。Conlon说，确定这些耐受的免疫驱动因素将是理解这种现象和开发解释宿主反应的治疗方法的关键。找出这些细胞在感染期间的位置以及驱动这种耐受性的原因非常重要。在体内，我们不是在谈论一个同质的人工环境，所以它可能是非常具体的东西，由宿主精心策划。在正在进行的研究中，Conlon和他的同事们正在探索对感染微环境的调整是否可以减少耐受细胞的形成。“显然，我们不想消除免疫反应，”他说，“但可能有微妙的方法可以针对它以减少病原体，但也允许抗生素更好地发挥作用。证明临床效用将需要许多研究线才能融合，Conlon补充道。通常，抗菌化疗的研究侧重于潜在药物的体外研究，然后是临床前和临床研究。对宿主-病原体相互作用的研究往往是一个独特的领域，它依赖于不同的技术，如动物感染模型，以了解免疫细胞如何与细菌相互作用，以及基因表达、毒素产生或其他生理因素的变化。“两者很少见面，这让我们对抗生素在体内如何工作缺乏了解，”Conlon说。“这造成了一个空白，留下了很多问题需要回答。
文献来源：
1.https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2215617119
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